β2糖蛋白I纯化及其稳定性分析.doc

　　β2糖蛋白I纯化及其稳定性分析 ：黄宏亮, 周红， 王婷， 石文霞, 李娜， 王海波 【摘要】 目的： 从正常人混合血浆中纯化获得β2糖蛋白Ⅰ（β2GPI），并对提纯蛋白的纯度及稳定性进行分析。方法： 采用HClO4沉淀、Heparin Sepharose CL6B亲和层析柱等纯化β2GPI；利用SDSPAGE、蛋白质印迹分析提纯蛋白的纯度；观察不同温度、NaCl浓度及防腐剂等条件下的β2GPI稳定性。结果： 本法获得了高纯度目的蛋白β2GPI（＞95%）。 β2GPI在浓度低于0.8 mol/L 的NaCl溶液中，置室温及4℃保存易降解变性，但在1.6 mol/L NaCl溶液中于室温及4℃保存60天均未见蛋白明显降解。结论： 利用本法能够得到高纯度的β2GPI，在使用和保存β2GPI时要考虑到其降解的可能性，注意保存条件，必要时冻干保存。 【关键词】 β2糖蛋白I；蛋白纯化；蛋白稳定性 　　［Abstract］ Objective: To purify β2glycoprotein I(β2GPI)from normal human plasma and analyze its purity and stability. Methods： β2GPI atography folloperature, concentration of salt and antiseptics. Results： β2GPI ethods and it′s purity ed more than 95%. The protein maintained in the concentration of lool/L NaCl might be degraded at room temperature even though at 4℃. But it aintained in 1.6 mol/L NaCl at room temperature or 4℃. Conclusion： Human β2GPI the plasma can be obtained by our methods. It is important to protect β2GPI from denaturazation in the process of conservation and regular use. It is the best e. 　　［Key g/L，其中60 %左右呈游离状态。 β2GPI与三酰甘油及肝素等具有高度的亲和作用，能激活脂蛋白脂酶，参与脂代谢等［1］。近年来， β2GPI及其抗体在抗磷脂综合征病理机制中的作用受到极大关注。研究发现， β2GPI是抗磷脂抗体的主要靶抗原，其抗体的产生在抗磷脂综合征的血栓形成中发挥着重要的作用［2，3］。然而， β2GPI及其抗体促血栓形成的具体机制还未完全阐明。本研究组近年来一直在进行这方面的探讨工作， β2GPI及其抗体是该研究工作的必备条件。因此，首先要纯化出β2GPI蛋白，并分析其特性，为深入的机制研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材 料 　　正常人混合血浆由镇江市中心血站提供。Heparin Sepharose CL6B亲和层析柱购自瑞典Amersham Biosciences公司；蛋白标准参照物购自立陶宛Fermentas公司； β2GPI标准品购自美国USBio公司；抗β2糖蛋白I单克隆抗体（MAB1066）购自美国Chemicon公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自博士德生物工程有限公司；丙烯酰胺、双叉丙烯酰胺、SDS和APS均购自美国Amresco公司；CHEMIDOC XRS凝胶成像系统购自美国BIORED公司；其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 血浆标本处理 100 ml正常人混合血浆中加入2.5 ml的2％NaN3（终浓度0.05％）,然后加入2.5 ml的70％HClO4，4℃搅拌30 min, 10 000 r / min离心30 min，取上清，用Na2CO3调pH至8.0，转移至透析袋中用0.02 mol/L TrisHCl / 0.03 mol/L NaCl(pH8.0)的缓冲液4℃透析后备用（S1）。 　　1.2.2 层析柱准备 称取Heparin Sepharose CL6B 1g溶胀于50 ml的0.02 mol/L TrisHCl / 0.03 mol/L NaCl(pH8.0)缓冲液中，弃去上层悬浮小颗粒。处理好的填料灌入玻璃层析柱（避免气泡）后，用以上相同缓冲液洗涤平衡后备用。 　　1.2.3 上样平衡 将上述处理过的样本（S1，约20 ml）小心加到Heparin Sepharose