人类β1，3半乳糖基转移酶7对人4IgB7H3的修饰作用初探.doc

　　人类β1，3半乳糖基转移酶7对人4IgB7H3的修饰作用初探 ：唐春花, 马震宇, 岳爱环, 行书丽，蒋俊华　张昊 曹静媛， 周迎会，吴士良 【摘要】 目的： 探讨人4IgB7H3基因转染人胃癌细胞株SGC7901后人类β1，3半乳糖基转移酶7（β1,3galactosyltransferase 7，β3GalT7）的表达变化，以期发现4IgB7H3与β3GalT7的相互关系。方法： 脂质体介导重组逆转录病毒载体pEGZTerm/4IgB7H3转染SGC7901细胞，筛选获得稳定表达4IgB7H3的亚克隆细胞株，通过RTPCR和蛋白质印迹方法检测β3GalT7的表达。结果： 成功获得稳定表达4IgB7H3的亚克隆细胞株SGC7901/4IgB7H3；β3GalT7随4IgB7H3的表达上调而上调。结论： 4IgB7H3蛋白的修饰成熟可能需要β3GalT7的作用。 【关键词】 4IgB7H3； β1，3半乳糖基转移酶7； SGC7901； 转染 ［Abstract］ Objective: CSF刺激的单核细胞上可诱导B7H3的表达［4］。近年来越来越多的研究表明，共刺激分子的调节性表达、相互作用及其信号传递在非常复杂的肿瘤免疫应答过程中起着极其重要的作用。B7家族是最具有代表性的共刺激分子，作为惟一能从抗原递呈细胞(APC)单向传递信号至T细胞的共刺激分子，B7家族成员在肿瘤中的作用引起学者的普遍关注。 人类β1，3半乳糖基转移酶7（β1,3galactosyltransferase 7，β3GalT7）是利用TBLASTN信息途径，以信息探针β3GalT1（基因库登入号：AF117222）在NCBI的EST数据库中进行同源筛选，并从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3半乳糖基转移酶家族中的一个新成员［5］。它的蛋白序列和其他β3GalT7有很高的同源性，并且在小鼠和大鼠中发现了其存在的证据。该家族在哺乳动物的生殖、发育、消化、肥胖、高血压发病、肿瘤发生等生理及病理过程中发挥作用，尤其在肿瘤的浸润转移过程中起着非常关键的作用［6］。 我们构建了能稳定表达人4IgB7H3基因的SGC7901基因转染细胞株，并初步探讨了4IgB7H3与β3GalT7的相互关系。 1 材料与方法 1.1 材 料 逆转录病毒载体pEGZTerm及2个辅助病毒载体pHIT456 和pHIT60 由德国Sefling教授惠赠，重组表达质粒pGEZTerm/4IgB7H3由苏州大学生物技术研究所构建保存；细胞株293T购自美国ATCC，SGC7901由本室保存；培养细胞所用的RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；小量质粒抽提试剂盒购自北京天根公司；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒和抗性筛选药物Zeocin购自美国Invitrogen公司；Polybrene购自美国Sigma公司；RTPCR试剂盒购自Promega公司；PE羊抗鼠IgG二抗购自上海晶美公司；抗人B7H3 单克隆抗体21D4为苏州大学医学生物技术研究所研制；β3GalT7多克隆抗体为本实验室研制。引物设计采用Geyx软件,并经基因库Blast进行同源检索后合成。引物由Invitrogen公司合成。β3GalT7 上游：5′TGCCCTTTGCTTACTGG3′，下游：5′GGTCTTTGAGCGTCTGGT3′，预期扩增产物长度474 bp；4IgB7H3上游:5′ACCATCACAGGGCAGCCTAT3′，下游:5′TCCTCAGCTCCTGCATTCTC3′，预期扩增产物长度155 bp；β肌动蛋白上游：5′CATGTACGTTGCTATCCAGGC3′，下游：5′CTCCTTAATGTCACGCACGAT3′，预期扩增产物长度250 bp。 1.2 方 法 1.2.1 含4IgB7H3基因的重组逆转录病毒颗粒的包装 经鉴定正确的阳性克隆在LB液体培养基中扩增培养，大量质粒抽提试剂盒抽提重组表达质粒pGEZTerm/4IgB7H3，尽可能保持无菌，-80℃冻存。将重组逆转录病毒载体pEGZTerm/4IgB7H3与2个辅助病毒pHIT456 和pHIT60 按2∶1∶1 的比例用脂质体法共转染6 孔板中60%～70%汇片且生长旺盛的293T包装细胞。细胞转染48 h 后，收集少量293T细胞，用倒置荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况， 计算 转染效率。同时包装制备阴性对照的逆转录病毒pGEZTerm。 1.2.2 表达人4IgB7H3抗性细胞株的感染和筛选 收集含逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清, 感染6孔板中5