刀豆蛋白A条件化培养基对体外培养的兔角膜内皮细胞生长的影响.doc

　　刀豆蛋白A条件化培养基对体外培养的兔角膜内皮细胞生长的影响 【摘要】 目的 研究刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)条件化培养基对体外培养的兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells, RCECs)生长的影响。方法 采用揭取后弹力层及内皮细胞联合组织块法进行RCECs的体外原代培养，分别用含有体积分数为5%、10%、15%、20% ConA的活化大鼠脾细胞条件上清液的RPMI 1640培养基进行RCECs原代培养，并用含10%(体积分数)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640培养基作为对照。神经烯醇化酶免疫组织化学染色法进行细胞鉴定；噻唑蓝比色法观察各组RCECs生长的状况；SPSS11.0 One-edium made up of ConA-activated spleen cells supernatant on cultured rabbit corneal endothelial cells (RCECs). Methods RCECs arily cultured in vitro by revealing descemet membrane and endothelium bining tissues masses. Culture medium ental groups colorimetry analysis munohistochemical staining for neuronal specific enolase (NSE). Results The RCECs munohistochemical assay. There ental groups pared al in 15% and 20% groups. Conclusion Conditioned medium ary culture; Concanavalin A (ConA); methyl thiazolyl tetrazolium (MTT ); neuronal specific enolase (NSE) 　　角膜内皮细胞(corneal endothelial cells, CECs)是维持角膜透明性的重要结构。CECs病变引起的致盲性眼病已经成为危害人们尤其是老年患者健康的重要原因之一。近年来，组织工程角膜成为角膜移植领域的 发展 趋势。随着体外培养CECs的成功，CECs移植的研究逐渐由实验室走向临床。CECs在体外的增殖能力有限。许多学者在实验中使用了大量的生长因子，如碱性成纤维生长因子(basic fibroblast gro groL)冲洗后并浸泡其中，置于4 ℃冰箱备用。 　　1.2 主要试剂及溶液配制 　　①主要试剂：RPMI 1640培养基，美国GIBCO公司；ConA，美国SIGMA公司；IMDM(iscove’s modified dulbecco’s medium)培养基，美国GIBICO公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，杭州四季青生物制品公司；胰蛋白酶，美国GIBCO公司；L-谷氨酰胺，美国SIGMA公司；噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)，美国SIGMA公司；兔抗人神经烯醇化酶抗体(neuronal specific enolase, NSE，美国SIGMA公司)及DAB显色试剂盒(美国VECTOR公司)由西安交通大学医学院第二附属 医院 病理科提供。②ConA活化脾细胞上清液制备：将大鼠脾脏制成单细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用IMDM培养基调整细胞密度至5×106/mL。移入24孔细胞培养板内，每孔2 mL，加入ConA 10 μL(100 μg/mL)，置于5%(体积分数)CO2培养箱内孵育；培养48 h，取出培养上清液，1 000 r/min离心10 min，通过葡聚糖凝胶G-25(sephadex G-25，SIGMA)过柱，过滤除菌(0.22 μm)，分装，-20 ℃储存备用。使用前加入0.1 mol/L的a-甲基甘露糖(a-methylmannoside, SIGMA)以中和上清液中残留的ConA成分。本实验中ConA条件上清液由第四军医大学空医系细胞培养室提供。③条件化培养基制备：每100 mL RPMI 1640培养基中分别加入5、10、15、20 mL ConA条件化上清液，10 mL FBS，60 mL IMDM液，青霉素100 u/mL，链霉素100 mg/L。 　　1.3 主要仪器设备 　　CO2培养箱(日本TOABAI ESPEC公司BNA-321D型)；倒置相差显微镜