嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞的作用.doc

　　嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞的作用 ：刘志元, 刘锦波, 张志坚, 龚爱华, 张俊 【摘要】 目的： 研究体外培养的大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)对活化的星形胶质细胞(astrocytes,AST)的作用。方法： 体外培养嗅鞘细胞和星形胶质细胞。星形胶质细胞经纯化传代,细胞融合后利用划伤法得到活化的星形胶质细胞,将嗅鞘细胞与活化的星形胶质细胞共培养24 h后,观察星形胶质细胞增殖能力的改变,以及其表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的变化。结果： 活化的星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养后,MTT实验表明其增殖能力增强;免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法测定结果表明共培养后活化的星形胶质细胞表达的GFAP和CSPG降低。结论： 嗅鞘细胞作用于活化后的星形胶质细胞以后,能够促进星形胶质细胞的分裂增殖,同时能够减少星形胶质细胞胶质化,降低抑制性细胞因子的表达。 【关键词】 嗅鞘细胞; 星形胶质细胞; 增殖; 胶质纤维酸性蛋白(GFAP); 硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG) 　　[Abstract] Objective: To study the effect of olfactory ensheathing cells on reactive astrocytes in vitro.Methods： Olfactory ensheathing cells and astrocytes Sprague Dae cultures easured among the normal group, active group,and the cocultured group. Results： TT细胞增殖检测试剂盒;插入式培养皿(Millipore公司,美国)。清洁级SD大鼠,1～7 d龄,购于江苏大学动物中心。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 嗅鞘细胞的分离和培养 取lt;1周的SD大鼠,显露并完整取下嗅球,剪碎组织,0.25%胰酶消化10 min,含10%FBS的DMEM终止消化,20%FBS的DF12制作细胞悬液。差速贴壁后转入PLL包被的培养瓶中,2 d左右OEC细胞贴壁,继续培养至细胞大部分融合。NGFRp75免疫荧光染色测定细胞纯度gt;80%。 　　1.2.2 星形胶质细胞的分离和培养 新生1～3 d的SD大鼠,取大脑皮质并剥除外膜,0.25%胰酶加0.05%EDTA消化,20%FBS的DF12培养基制成细胞悬液,调节细胞密度为1×106,接种于6孔板差速贴壁处理1 h左右,转入新的6孔板中继续培养,3 d后半量换液,继续培养至细胞融合达到90%左右。 　　将培养板在37 ℃恒温摇床中以180 r/min振荡18 h后,消化传代,转入包被PLL的24孔板中继续培养,一般3～5 d后即融合。 　　1.2.3 星形胶质细胞的活化 星形胶质细胞融合后,利用枪头制造机械损伤,无血清完全培养基继续培养24 h后即得到活化的星形胶质细胞。 　　1.2.4 星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养 嗅鞘细胞大部分融合后,消化,用无血清的DMEM制成1×105/ml密度的细胞悬液。嗅鞘细胞培养上清液通过嗅鞘细胞融合后加入无血清的DMEM培养24 h获得。 　　传代星形胶质细胞活化结束以后,将星形胶质细胞分成4组,分别为:正常组、活化组、与嗅鞘细胞共培养组(又分直接共培养组和间接共培养组)。其中正常组和活化组加入无血清DMEM,直接共培养组加入等量的嗅鞘细胞悬液,间接共培养组分为两种方式:24孔板利用孔径0.4 μm的插入式培养皿实现;96孔板使用嗅鞘细胞培养上清液(用于MTT实验)。将上述的细胞继续培养24 h后进行后续试验。 　　1.2.5 MTT法检测星形胶质细胞增殖能力 共培养结束后,于96孔板中4个不同组别每孔加入10 μl的MTT溶液,在细胞培养箱中继续孵育4 h;每孔加入100 μl的Formanzan溶解液继续孵育至深紫色结晶Formanzan全部溶解;570 nm测定光密度值。 　　1.2.6 免疫细胞荧光法检测细胞形态,数量和GFAP、CSPG的表达 共培养24 h以后,24孔板PBS清洗;4%多聚甲醛固定; 0.5% Triton X100孵育2次; 3%H2O2处理;含5%山羊血清的PBS溶液中孵育;然后加入小鼠抗大鼠GFAP(1∶100)和小鼠抗大鼠CSPG(1∶200)后室温孵育1 h;将标本加入荧光FITC羊抗小鼠IgG(1∶50),室温暗处孵育1 h后,Olympus 荧光显微镜IX71观察拍照。 　　对于GFAP和CSPG以及不同的细胞培养组,分别选取源自不同批次试验的不同培养孔的多个视野的图像进行分析。将图像转换成灰度值