地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探.doc

　　地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探 ：樊慧杰　康慧芳　姚建强　王晓媛　杨利军　牛勃 【摘要】 ：目的 研究地龙体内两种新型脱氧核糖核酸酶(LDs)的部分生化性质,并对其作用进行初步探索。方法 采用Sephacryl-200柱层析、毛细管等电聚焦电泳法、琼脂糖凝胶电泳等方法。结果 初步得出LD1、LD2分子量为126、62 kDa；确定了等电点分别为6.12、6.05。LD1、LD2对细菌质粒DNA、λDNA均有分解作用。结论 地龙中的LDs是一种新型的脱氧核糖核酸酶。明确LDs的分子量、等电点有助于优化LDs的提取工艺以及LDs的进一步研究。对细菌质粒DNA、λDNA的降解提示LDs有可能对抗细菌的耐药性。 【关键词】 地龙　脱氧核糖核酸酶　分子量　等电点 　　Abstract：Objective To study partial biochemical characterization and effect of lumbricus dornases (LDs). Methods Sephacryl-200 column chromatography, CIEF and agarose electrophoresis ine LDs. Results The molecular id and λDNA. Conclusion LDs is a neination of molecular id and λDNA degradation imply that LDs can oppose bacteria drug resistance. 　　Key bricus；dornases；molecular acia；Coomassie Brilliant Blue G250, Fluka；毛细管等电聚焦试剂盒(cIEF3-10 Kit)；质粒(pBV220),由本实验室自备；λDNA,Sigma公司产品。其它所用试剂均为分析纯。 　　1.2 主要仪器 　　Gradifrac V1.2层析系统,pharamacia公司；毛细管电泳仪：BECKMAN 55002。 　　2 实验方法 　　2.1 分子量测定 　　凝胶过滤层析(分子筛)法：参照 文献 [4]方法。 　　2.2 等电点测定 　 毛细管等电聚焦电泳法：参照文献[5]方法。 　　2.3 LDs对质粒的降解作用 　　取3 μL质粒(pBV220),分别加入LD1、LD2 10 μL,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。 　　2.4 LDs对λDNA的降解作用 　　取2 μLλDNA,分别加入LD1、LD2 10 μL,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。 　　3 结果 　　3.1 凝胶过滤层析(分子筛)测定LDs分子量 　　以标准蛋白质洗脱体积为纵坐标,标准蛋白质分子量的对数为横坐标,绘制标准曲线。根据LD1、LD2的洗脱体积,查标准曲线,并 计算 出用Sephacryl S-200测得LD1、LD2分子量分别为126、62 kDa。 　　3.4 LDs对λDNA的降解作用(见图2) 　　LDs与λDNA作用30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。LD1、LD2 作用后的λDNA条带减弱,图2的下方有云雾状的阴影,为λDNA的降解产物。说明LD1、LD2有降解λDNA的作用。图2中看不出LD1、LD2对λDNA降解作用有明显的差别。 　 　4 讨论 　　脱氧核糖核酸酶(DNase)已在不同的物种中发现,目前针对其研究较多的是DNaseⅠ、DNaseⅡ。DNaseⅠ是Sachs[6]1905年首次在牛胰腺中发现,现对DNaseⅠ的研究已扩展到人、鸡、鼠、犬及鲤鱼等动物。已纯化出不同的DNaseⅠ的分子量在32～41 kDa范围之间,等电点在3.9～4.7之间。DNaseⅡ存在于各种哺乳动物的组织中[7],尽管来自各种不同种属和组织的DNaseⅡ的化学性质并不完全一样(如分子量、亚基结构),但这些酶的酶学性质非常相似。迄今已纯化出不同的DNaseⅡ的分子量范围在26.5～45 kDa之间。我们发现的LD1、LD2分子量为126、62 kDa；等电点为6.12、6.05。LDs与DNaseⅠ、DNaseⅡ分子量有很大差别,分子量远远大于DNaseⅠ、DNaseⅡ；LDs的等电点也明显不同于DNaseⅠ。可以推测,LDs是新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。 　　质粒是细菌染色体以外能自主复制的,双链共价闭合环状DNA。细菌对药物产生抗性,原因多种。现在研究的热点是耐药性质粒(其携带耐药基因),质粒可以从一个细菌进入另