姜黄素对鼻咽癌细胞迁移的影响及相关机制研究.doc

　　姜黄素对鼻咽癌细胞迁移的影响及相关机制研究 ：熊晖， 姚运红， 蔡琼珍， 李飞虹， 余建华 【摘要】 目的 研究姜黄素对鼻咽癌增殖和迁移的影响，探讨姜黄素抗鼻咽癌的可能机理。方法 考马斯蓝染色和图像分析法检测不同浓度姜黄素(0、10、20、40μmol·L-1)对H5细胞骨架的影响;细胞刮痕实验观察不同浓度姜黄素对H5细胞迁移能力的影响;以免疫细胞化学方法检测EGFR、PA、PI3K、Tubulin-β在各组细胞中的表达情况;RT-PCR方法检测不同浓度姜黄素对H5细胞EGER mRNA表达的影响;通过体内H5裸鼠移植瘤实验，观察姜黄素对移植瘤生长的影响，免疫组织化学方法检测不同浓度姜黄素作用H5裸鼠移植瘤组织中EGFR、PA、PI3K、Tubulin-β的表达。结果 随着姜黄素浓度的增加，刮痕边缘的H5细胞向划痕外迁出减少(Plt;0.05);H5细胞骨架染色逐渐降低(Plt;0.01);不同浓度的姜黄素可抑制H5细胞中EGFR、PA、PI3K和Tubulin-β的表达，并使EGFR mRNA表达下调。姜黄素抑制H5裸鼠移植瘤生长，用药组的移植瘤组织坏死更为广泛(Plt;0.01);高剂量姜黄素处理组H5裸鼠移植瘤组织中的EGFR表达与对照组相比明显减弱(Plt;0.05)。Spearman相关分析显示EGFR、PA和Tubulin-β随姜黄素剂量的增高表达减弱，呈剂量效应关系(Plt;0.05或0.01);EGFR与PI3K、EGFR与Tubulin-β表达具有相关性(Plt;0.05);PA与PI3K表达具有相关性(Plt;0.05)。结论 姜黄素可能通过下调EGFR影响细胞骨架，从而抑制鼻咽癌细胞H5的增殖及迁移。 【关键词】 姜黄素;鼻咽癌;细胞骨架;表皮生长因子受体;微管蛋白-β 　鼻咽癌是我国广东、广西西江流域高发的恶性肿瘤，放射 治疗 为首选的治疗方法，放疗后5年生存率达50%左右[1]，部分鼻咽癌患者根治量放疗后出现鼻咽或颈部复发和(或)远处器官转移。姜黄素毒副作用小，具有广泛的药理作用，是一种具有良好应用前景的抗癌新药，许多体内外实验已经证实，姜黄素对肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有直接杀伤作用[2-4]。本文研究姜黄素对人鼻咽癌细胞迁移能力的影响，探讨姜黄素抗鼻咽癌的可能机制，为姜黄素应用于鼻咽癌治疗提供一定的理论和实验依据。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人鼻咽低分化鳞癌细胞系E-2Z亚克隆株H5(简称H5)由广东医学院病 理学 教研室建株并保存。BALB/c-nu小鼠由广东医学院实验动物中心SPF裸鼠室提供(合格证号：粤检证号2004A030号)。姜黄素(粉剂)购自杭州绿天公司，多聚赖氨酸购于武汉博士德，SP-9000免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、PA和Tubulin-β购于北京中杉金桥生物技术有限公司，小鼠抗人单抗EGFR和PI3K购自晶美生物工程有限公司。一步法RT-PCR试剂盒购自基因公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 H5细胞于RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5 % CO2培养箱内常规培养，实验所用细胞均处于对数生长期，存活率gt;95%。 　　1.2.2 细胞骨架抽提及染色 根据MTT的实验结果[5]，选用 10、20、40μmol·L-1姜黄素作用H5，以0μmol·L-1姜黄素作用为对照组，24h后分别用PBS、1.5% Triton X-100和M-缓冲液振荡洗涤，3%戊二醛固定，考马斯蓝染色，封片。200倍显微镜下观察、摄影。每例选上、下、左、右、中各100个形态清晰的细胞，采用图像分析软件Image pro 6.0比较细胞浆染色的累积光密度值(integrated optical density，IOD)。 　　1.2.3 细胞刮痕实验 用无菌消毒的细胞刮沿培养皿直径处刮除一半面积的H5细胞，EDTA洗3次，分别用0、10、20、40μmol·L-1姜黄素作用24h后，观察并 计算 各组在刮除部位的迁移细胞数，实验重复3次。 　　1.2.4 免疫细胞化学染色 取出0、10、20、40μmol·L-1姜黄素作用24h后的H5均按照SP试剂盒说明书进行，所用抗体的工作浓度均为1∶100。试验中以已知阳性片为阳性对照、PBS 代替一抗作为空白对照。每组随机计数1000个细胞，200×显微镜下观察、摄影。采用图像分析软件Image pro 6.0 比较EGFR(表皮生长因子受体)、PA 、PI3K和Tubulin-β阳性表达的累积光密度值(IOD)。 　　1.2.5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 提取0、10、20、40μmol·L-1姜黄素作用24h后的H5细胞总