- 1、本文档共6页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
宁夏地区绵羊博尔纳病病毒自然感染状况研究.doc
宁夏地区绵羊博尔纳病病毒自然感染状况研究
:刘建, 马彦, 王振海, 谢鹏
【摘要】 目的 探讨 中国 宁夏地区绵羊博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的 自然 感染状况,并分析比较中国宁夏地区绵羊自然感染BDVp24基因序列与国外人和动物BDV分离株及其标准株Strain V和He/80的同源性。方法 采用巢式逆转录荧光定量PCR(FQ-nRT-PCR技术)检测了中国宁夏地区268例绵羊PBMCs中BDVp24基因片段,对阳性标本FQ-PCR产物进行基因序列测定,测序结果应用BLAST软件以及DNAsist 5.0 软件对测序结果分析,与国外人与动物的BDV分离株以及标准株StrainV和He/80进行序列比较。结果 268例中4例绵羊外周血BDVp24基因片段阳性,阳性率为1.49%;测序分析结果表明,宁夏地区绵羊感染的BDVp24的核苷酸序列与马源性病毒株H3575同源性最近,同源性为98.84%(85/86),与标准株Strain V和He/80同源性为94.19%和100%。并且它们编码的氨基酸序列相同。结论 宁夏地区绵羊中可能存在动物源性的BDV自然感染,该地区感染的BDV p24核苷酸序列与马源性病毒株H3575、标准株Strain V和He/80存在高度的同源性,其感染可能相同亦或存在相互之间感染的可能
【关键词】 Borna病病毒;感染;巢式逆转录荧光定量PCR
博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种非分节段的单股负链嗜神经的RNA病毒,是引起人和动物共患病博尔纳病(Borna Disease,BD)的病原体[2],感染后主要侵犯中枢神经系统导致严重后果,有可能引起动物之间的传染而引起大规模动物死亡。迄今为止,中国虽未见大规模的BDV流行报道,但有报道在新疆、重庆、宁夏以及 台湾 地区的马、牛、人等存在散在BDV自然感染。本研究应用FQ-nRT-PCR技术检测宁夏地区268例绵羊外周血单个核细胞(PBMCs)中BDVp24基因片段,对阳性标本FQ-PCR产物进行克隆和测序分析,以探讨中国宁夏地区绵羊BDV自然感染状况,进而比较分析中国绵羊自然感染的BDV与国外人和动物BDV分离株及其标准株Strain V和He/80在种系发生中的关系。
1 材料和方法
1.1 研究对象 268例绵羊均来自宁夏地区,每例采外周血5mL,EDTA抗凝。
1.2 主要试剂及仪器 主要试剂:淋巴细胞分离液(Ficoll-conray液),Trizol RNA 提取液(购自BioFlux),Borna病病毒荧光定量PCR诊断试剂盒(广州达晖生物技术有限公司),PE7700 FQ-PCR(美国ABI公司)。
主要实验仪器:752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂),Bio-Rad PCR仪(日本),Heraeus低温高速离心机(德国),Rotor-Gene 6000荧光PCR仪(澳大利亚),SANYO ULTRA LOCs,再按照RNAisoTM Plus RNA提取试剂提取总RNA。提取的RNA保存在-80℃冰箱。2)对RNA样本进行纯度检测、浓度 计算 和完整性检测:将上述保存于-70℃冰箱中的绵羊PBMCs RNA样本随机取出4例,4℃8000 r·min-1离心5min,弃上清液;再用75%乙醇重复洗涤,4℃8000 ·min-1离心5min,吸干残余液,RNA沉淀置室温干燥15min去除残留乙醇;加入无RNase水50μL,55℃水浴10~15min溶解RNA;取5μL提取的RNA稀释100倍,用紫外分光光度计测OD260、OD280及二者比值,计算RNA浓度,公式为:OD260×核酸稀释倍数×40/1000,单位μg·μL-1。其余RNA置-70℃冰箱中备用。采用1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5μg·μL-1)电泳。取RNA样品10μL上样,以3~4V·cm-1的电压电泳25min,在凝胶成像分析仪中观察结果并照相。3)FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段阳性定量标准曲线的建立:将鉴定好的质粒(重庆医科大学提供)测定OD值,计算拷贝数,按107、106、105、104、103拷贝数·μL-1浓度梯度稀释,加5μL于不同反应管中,在PE7700 FQ-PCR上进行扩增。同时每8s检测1次PCR产物的量(即反应管中荧光值Rn的变化)。其原理是在常规PCR基础上,在反应体系中加入了一种带有2个荧光基团标记的特异性寡核苷酸探针进行FQ-PCR。所有反应信息资料被Opticon-2FQ-PCR扩增仪收集并储存于其附件Macintosh电脑分析软件中,反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制出标准曲线。
1.
您可能关注的文档
- 奥运福娃乐园品牌效应浅析.doc
- 奥运福娃的审美形象与民俗文化蕴涵.doc
- 女性精神障碍患者受性侵害案例临床特征分析.doc
- 女性绝育方法及护理.doc
- 好孩子情感障碍个案研究..doc
- 如何使用LVM管理分区并调整大小.doc
- 如何使用PHP DOM创建动态XML文件--.doc
- 如何使用PHP DOM创建动态XML文件.doc
- 如何使用XML实现多渠道接入网站的构架--.doc
- 如何做好高一新生班主任工作..doc
- (4篇)XX区抓党建促基层治理培训心得体会汇编12.docx
- 汇编1154期-在培训班上的讲话汇编(3篇).doc
- 汇编1173期-专题党课讲稿汇编(3篇)112.doc
- 汇编1076期-主题党课讲稿汇编(3篇).doc
- 汇编1177期-学习心得体会汇编(3篇)112.doc
- (6篇)党和国家机构改革心得体会汇编.docx
- 汇编1166期-坚定理想信念、全面从严治党、担当作为专题党课讲稿汇编(3篇)112.doc
- 汇编1174期-专题党课讲稿汇编(3篇)112.doc
- 教育13期-主题教育学习心得体会、研讨发言材料参考汇编(3篇).doc
- 汇编1458期-心得体会研讨发言提纲参考汇编(3篇)123.doc
最近下载
- 露天非煤矿山施工方案.docx VIP
- 标准图集-13G322-1-钢筋混凝土过梁 - 烧结普通砖、蕉压灰砂翩。蒸压粉煤灰砖砌体.pdf
- 危大工程-模板工程及支撑体系-安全管理措施.doc VIP
- 高中历史选择性必修3《文化交流与传播》教学设计(修订版).doc
- 废水处理可行性研究报告.docx VIP
- 统编人教部编版小学语文四年级下册语文第二单元测试卷A(附答案).docx VIP
- GB-55015 空气源热泵技术解读-2024制冷展.pdf
- 2025年郑州旅游职业学院单招职业技能测试题库必考题.docx VIP
- 基于PLC的教室照明自控系统设计.doc
- GB50175-2014 露天煤矿工程质量验收规范.docx
文档评论(0)