小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达.doc

　　小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达 ：李娜, 朱道银, 帖儒修, 王瑜伟 【摘要】 　　目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1（Ipr1）基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RA: To construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of mouse Ipr1 and EGFP and to study its expression in murine macrophage RAETHODS: The coding sequence of Ipr1 gene plified from the total RNA of C57BL/6J mouse thymus by RTPCR. The gene id icroscopy. RESULTS: The plified. The rebinant plasmid urine macrophage RAtb）的人中仅10%的人 发展 为结核病,除环境等因素外, 遗传可能决定了机体的易感性[1]。2005年Pan等[2]在小鼠巨噬细胞内发现了一个介导巨噬细胞抗胞内病原体的基因, 称为胞内病原体抗性基因1（intracellular pathogen resistance 1, Ipr1）, 该基因与结核病的易感性有着密切的关系。Ipr1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬细胞表现为坏死, 从而有利于细菌在宿主体内的繁殖与扩散; 而表达Ipr1基因的小鼠, 巨噬细胞则发生凋亡, 对Mtb的感染表现出天然的抗性。Ipr1基因抗Mtb的具体机制尚不清楚, 因此了解Ipr1基因在巨噬细胞抗Mtb固有免疫和适应性免疫中的作用具有重要意义。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 清洁级C57BL/6J小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。Clontech公司质粒载体pEGFPC1、 大肠杆菌TOP10、 小鼠巨噬细胞株RAI1640培养液购自Gibco公司, 胎牛血清为杭州四季青公司产品。转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。激光共聚焦显微镜为德国Leica TCSNT。 　　1.2 方法 　　1.2.1 C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA的提取 摘眼球放血颈椎脱臼处死小鼠, 无菌操作取胸腺组织, 迅速放入液氮, 研磨后按组织/细胞总RNA抽提试剂盒说明提取总RNA, 去离子甲酰胺溶解, 15 g/L琼脂糖凝胶电泳, -70℃保存。 　　1.2.2 RTPCR 根据以发表的Ipr1基因序列（NCBI AY845984）设计2条引物, 在其5′端分别加上KpnⅠ、 BamHⅠ限制性酶切位点, P1: 5′TGCGGTACCATGTTCACTCTGACCAAAGC3′, P2: 5′CGCGGATCCCTAGGCACCCTTCTTTTGA3′。内参阳性对照用一对扩增βactin的222 bp大小片段的引物, P3: 5′GCTGTCCCTGTATGCCTCT3′, P4: 5′TTGATGTCACGCACGATTT3′。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit试剂盒说明进行RTPCR, 逆转录条件为50℃ 30 min, 94℃ 2 min; PCR条件为98℃变性10 s, 59℃退火30 s, 72℃延伸90 s共30个循环。10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察后胶回收符合目的基因大小的条带。 　　1.2.3 克隆至pEGFPC1载体 PCR胶回收产物与pEGFPC1分别用限制性内切酶KpnⅠ、 BamHⅠ酶切4 h后经PCR产物纯化试剂盒分别纯化PCR产物和载体大片段, 用DNA Ligation Kit Ver.2.0试剂盒中的Solution Ⅰ将载体大片段与PCR产物连接, 反应条件为16℃ 1 h。连接产物转化至CaCl2 法制备的感受态大肠杆菌 TOP10中, 涂布含有30 mg/L卡那霉素的LB平板, 37℃过夜, 次日挑取阳性菌落, 转种至含有 30 mg/L卡那霉素的LB培养液中200 r/min 37℃摇菌过夜, 收集菌体提取质粒后10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察, 阳性质粒进行PCR、 KpnⅠ/BamHⅠ 双酶切鉴定正确后送上海生工测序。 　　1.2.4 细胞转染及表达产物的检测及细胞内定位 小鼠巨噬细胞株RAI1640培养液置37℃、 50 mL/L CO2培养箱进行培养, 在细胞状态良好时常规胰酶消化转种至6孔板及预先放入8 mm×8 mm载玻片的24孔板中, 待细胞状态良好及细胞汇片至70%时按转染试剂Lipofectami