川芎嗪抗大肠癌sw620裸鼠移植瘤血管生成及抑瘤机制的实验研究.doc

　　川芎嗪抗大肠癌sw620裸鼠移植瘤血管生成及抑瘤机制的实验研究 ：李雷宇，张俊华，张银旭，李伟 【摘要】 目的:探讨川芎嗪对大肠癌实体瘤及其血管生成的抑制作用与机制。方法: 建立大肠癌sethylpyrazine on angiogenesis of solid tumor in mice and its mechanism. Methods: P)购自郑州卓峰制药厂，批准文号为国药准字重组人血管内皮抑制素注射液(恩度)购自山东先声麦得津制药有限公司，批准文号为国药准字鼠抗人VEGF和CD34、HIF1α单克隆抗体购自北京中杉金桥公司。 　　1.2 移植瘤模型的建立 　　培养sl-1，加入PBS液，于裸小鼠腋后方皮下注入0.2 ml，观察其皮肤表面移植瘤成功率。 　　1.3 实验分组 　　将30只荷瘤裸小鼠随机分成5组，每组6只。于接种后第8天时开始成瘤，14 d时开始给药，分组及用药情况如下：(1) 生理盐水组,生理盐水0.2 ml·次-1每日腹腔注射1次，共21次;(2) TMP低剂量组,TMP 50 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次;(3) TMP中剂量组,TMP 100 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次;(4) TMP高剂量组,TMP 200 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次;(5) 恩度组,恩度20 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次。 　　1.4 一般检测 　　给药后，用游标卡尺测量荷瘤小鼠肿瘤的最长径(a)和最小径(b)，按V=0.5 ab2 计算 肿瘤体积，每周测量2次。停药后脱颈处死裸鼠，剥取移植瘤，称瘤重并计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。 　　1.5 HE及免疫组化染色 　　取肿瘤组织，10%甲醛固定、石蜡包理、切片、HE染色，光镜观察。采用免疫组化SABC法检测肿瘤组织CD34以及血管内皮生长因子(vascular endothelial grog，加入细胞裂解液、研磨、离心，考马斯亮兰法测定总蛋白浓度。取总蛋白40 μg，电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭，加入一抗、二抗孵育，BCIP/NBT显色，经自动电泳凝胶成像分析仪对缺氧诱导因子1α(hypoxia inducer factor1, HIF1α)进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带的比值代表目的基因蛋白的表达水平。 　　1.8 统计学处理 　　数据分析采用SPASS 13.0软件，Plt;0.05视为差异具有统计学意义，数据用 x±s表示,组间、组内比较用单因素方差分析法。 　　2.2 川芎嗪对肿瘤质量及抑瘤率的影响 　　给药结束后,TMP中、高剂量组以及恩度组肿瘤质量显著低于生理盐水组，TMP低剂量组肿瘤质量与生理盐水组相比无明显差异(Pgt;0.05)，见表1。表1 TMP各剂量组及恩度组对sm3时，其继续生长就需要新生血管维持营养供给和排泄代谢产物。如果没有新生血管长入，肿瘤就将保持休眠状态甚至退化[3]。有研究显示，MVD水平与肿瘤的淋巴结转移、浸润深度、TNM分期密切相关[4]。因此，控制血管的生成已经成为抑制肿瘤生长的重要靶点[5]。本研究显示，TMP中、高剂量组可显著降低肿瘤微血管密度，抑制肿瘤血管的形成，并与肿瘤的体积和质量减少密切相关，表明川芎嗪抑制肿瘤的生长可能是通过抑制血管生成实现的，这与既往的报道一致。肿瘤细胞能够分泌多种血管生成因子,其中VEGF是高效、高特异性作用于血管内皮的促血管生成因子[6]。 　　大量实验证实VEGF是肿瘤中发现的最重要的血管生成因子[7]，肿瘤细胞原癌基因突变或肿瘤组织中缺氧因素均可诱导其产生，Schoppmann等[8] 分析发现，HIFlα与VEGF显著相关，HIFlα表达增加可使肿瘤血管形成因子VEGF表达升高[9-10]。因此，HIFlα是缺氧状态下血管生成的核心调控因子，通过影响VEGF的表达，可直接参与血管生成的全过程[11]。研究结果显示，TMP中、高剂量组VEGF、HIF1α表达均显著降低，且有一致性，二者与肿瘤血管生成的减少亦相关。这一结果提示，川芎嗪可能是通过抑制HIF1α的表达，进而使VEGF表达降低，最终起到抑制血管生成的作用。 　　许多实体肿瘤都具有缺氧的微环境，肿瘤细胞对缺氧的自身调节和适应机制主要是通过新生血管形成实现的。因此，如果改善了肿瘤组织的乏氧环境，就有可能抑制新生血管的形成，从而延缓和抑制肿瘤的生长[12]。中医的活血化瘀法是 治疗 肿瘤的重要方法之一，其抑瘤的靶点与多种因素有关[13]，但尚未见到有关改善组织乏氧、抗实体瘤血管生成的报道。本研究表明，活血化瘀药川芎嗪可以抑制肿瘤的生长，其机制可能与活血化瘀药可以改善肿