snp突变点检测方法进展( 完整版).ppt

优势 序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列； 遗传标记系统的个人识别能力有限； 限制酶消化条件较高。 局限性 微测序技术（SNaPshot） 焦测序技术（Pyrosequencing） 微测序法是近年来出现的一种基于特异等位基因的高通量SNPs 检测技术。 基本原理 首先设计一个引物,其3’端结束在突变位点前一个碱基。然后在反应体系中加入ddNTP。只有ddNTP 与模板DNA 被检测位点处的核苷三磷酸互补时,延伸反应才发生,但仅在连接一个碱基后就停止，通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断SNP类型。 基本步骤 扩增、引物延伸和分析。 (Minisequencing) 特异性高； 引物设计简单； 反应条件易于优化； 分辨能力高。 随着科技的进步，SNP突变点检测方法在继续改进演变。我们选择经济实用的技术方法来满足自己所做课题需求。就目前来说，SNP检测技术手段还有待进一步提高。 科研在呼唤着一种最为理想的SNP检测方法，其能具备以下优点: 适合自动化操作, 简便快速; 分析费用低, 特殊试剂少; 反应要精密, 不纯的样品也可以可靠的分析; 数据分析简单, 易于自动化; 反应的通量大而灵活。 * * * * 这部分内容要展开讲解。 SNP突变点检测方法 21世纪是生命科学的时代，随着“人类基因组计划”的完成，揭开了人类遗传信息的秘密。人类已了解自己基因组的全部核苷酸序列，在全面寻找功能基因的同时，“人类基因组计划”的另一个重要目标是阐明在特定基因组区域内的序列差异。 第1代标记：RFLP 第2代标记：VNTR 、STR 第3代标记：SNP 第4代标记：CNV 定义： 单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置发生了转换,颠换,缺失和插入等变化而引起的序列多态性，而且任何一种位基因在群体中的频率不小于1%。 SNP在人类基因组分布广泛。某些SNP直接影响蛋白的结构表达及遗传稳定性等。对基因组SNP的分析是研究个体, 系谱, 和人种特征以及遗传疾病治疗的重要线索。 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP） 据估计,大约有105个SNP分子标记将被用于基因功能及与疾病的相关性的关联研究。2001年, SNP协会( The SNP Consortium)构建了含1. 42 ×106 个SNP、密度达1个SNP /1. 9 kb的人类遗传图谱，这对开展致病基因的定位和人类起源与进化的研究非常重要。 目前SNPs分析的基本方法已达20余种,参考相关文献，大致分为八大类，现就重点介绍与我们课题组相关的实验方法。 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP） 以构象为基础 基于PCR 荧光标记检测 内切酶酶切技术 引物延伸法 寡核苷酸连接分析 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP） 基于物理技术 其它 相关技术 单链构象多态性（SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 变性高效液相色谱分析技术（DHPLC） (一)PCR-SSCP 基本原理: 经PCR 扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并保证在单链状态下,然后在一定浓度的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA ,可以因其顺序或单个碱基差异,所形成的空间构象就会不同,其在凝胶中泳动速度不一样,从而显示出带型的差异,即多态型 保持在单链状态 非变性凝胶电泳 text2 构象不同呈现多态性 text3 DNA 单链构象同双链一样,也包括一级结构、二级结构,其空间结构中最主要的是发夹结构。 发夹结构是决定DNA 单链构象多态性的分子基础。 操作简单，步骤少，周期短 优 点 1 成本低 2 适用于大样本筛选 3 DNA模板纯度要求不高，所需量少 4 缺 点 1 随DNA片段长度增加，检测的敏感性降低 2 会出现假阴性结果 3 对A=T检出率无C G好，有局限性 4 不能检测变异的位置