甲基化特异性PCR技术的质量控制及改进.doc

　　甲基化特异性PCR技术的质量控制及改进 【摘要】目的：改进甲基化特异性PCR(MSP)技术并控制实验质量.方法:采用改进的MSP法检测正常胃粘膜及胃癌组织中caveolin1基因的甲基化状况.运用饱和酚氯仿抽提法提取DNA，其中石蜡包埋组织连续切片厚度为8μm；采用热启动PCR：反应体系为25μL、变性温度设定为95.5℃、循环数设定为30.结果：新鲜组织较石蜡包埋组织更适于MSP实验，但福尔马林固定石蜡包埋组织同样可用于MSP实验，并且8μm厚的石蜡包埋组织能获得较完整的DNA链.热启动PCR效果良好：25μL体系敏感性优于50μL体系,95.5℃可以使含CpG岛的DNA链解链更完全,30个循环足以扩增小于150bp的目的片段.结论：采用改进的MSP技术，可获得较好的DNA模板，提高实验的灵敏度和成功率，更适于甲基化的研究. 【关键词】甲基化；聚后酶链反应；DNA/分离和提纯；胃肿瘤 0引言 肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特征，是多基因遗传学和表遗传学共同起作用的结果［1］.在表遗传学机制中，DNA甲基化研究最多，也是最深入的一种机制.目前，针对DNA甲基化的研究方法中，甲基化特异性PCR（methylationspecificPCR,MSP）技术是最基础和最可靠的方法.现行的实验多采用新鲜组织作为标本，但医院病理科保存的大量石蜡包埋组织，是分子生物学研究材料的可靠,也是进行回顾性研究的宝贵资源.本研究从石蜡包埋组织及新鲜组织中提取DNA，运用MSP技术对胃癌组织及正常胃粘膜中的caveolin1基因第一外显子CpG岛的DNA甲基化状况进行了检测，并对部分实验步骤进行了调整和改进，取得了较好的效果. 1材料和方法 1.1材料7例正常胃粘膜和37例胃癌组织（6例福尔马林固定石蜡包埋组织、31例新鲜组织）均来自兰州军区总医院病理科200612/200708手术及存档石蜡包埋标本.患者术前均未经辅助放、化疗.MSP试剂盒购于美国CHEMICON公司.caveolin1基因甲基化和非甲基化引物由大连宝生物工程有限公司合成，PCR相关试剂亦购自大连宝生物工程有限公司. 1.2方法 1.2.1新鲜组织及福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA的提取采用传统的饱和酚氯仿抽提法提取DNA［2］，通过紫外分光光度仪检测DNA含量，选取A260nm/A280nm值在1.8～2.0的标本，并对DNA的完整性进行检测，选取理想标本进行实验.提取组织冻存于-40℃.实验主要操作步骤简述如下：石蜡包埋组织切片厚度8μm,连续切片8张，经二甲苯（2次）脱蜡，过无水乙醇（2次）；加入DNA消化缓冲液500μL(0.1mol/LEDTA,10mmol/LTris,10g/LSDS,调pH8.0)，再加入20g/L蛋白酶K7μL并过夜（37℃，24h）；用酚氯仿（1∶1）法抽提(2～3次)，沉淀于70μL三蒸水中（已消毒）.新鲜组织称取40mg，匀浆器研磨后其余步骤同石蜡包埋组织. 1.2.2DNA甲基化修饰(亚硫酸氢钠修饰)甲基化修饰严格按照试剂盒说明书进行，步骤简述如下：①DNA修饰：每个样本取1μgDNA溶于100μL三蒸水中，加入7μL3mol/LNaOH变性处理10min(50℃水浴)，加入550μL试剂Ⅰ（pH5.0)水浴16h(50℃，避光)；②脱盐处理：加入5μL试剂Ⅲ（pH5.0）并混匀，加入750μL试剂Ⅱ37℃水浴10min，加入1mL700mL/L乙醇,6000g离心20s,弃上清，共做3次，高速离心2min，吸去剩余悬浮液；③完全甲基化（脱磺酸基作用）、二次脱盐、DNA纯化：加入50μL20mmol/900mL/L乙醇溶液到标本中，短暂摇匀，37℃水浴5min，6000g离心20s，加入1mL900mL/L乙醇振荡，再次离心，重复本步骤1次，高速离心2min，吸去剩余悬浮液，室温放置10min，加入TE（pH7.5）缓冲液25μL并混匀，60℃孵育样本15min，高速离心4min，移出混悬液（样品DNA）到新试管，置于-40℃. 1.2.3MSP根据GenBank中caveolin1基因外显子1的基因序列(AF095591)，采用Prime5.0软件，针对外显子1的启动子CpG岛区域设计并合成引物.甲基化引物：Sense，5′gggttcaaagcgggaaaatg3′；Antisense，5′taggcactccccaaggttct3′；非甲基化引物：Sense，5′gggtttaaagtgggaaaatg3′；Antisense，5′taaacactccccaaaattct3′，产物大小均为139bp.由于修饰试剂昂贵，故从所提标本中选取最理想的DNA样本进行修饰，其中正常胃组织7