白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究.doc

　　白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究 ：卓佳，陈柏坤，黄慧燕，徐瑜，张洪勤 【摘要】 　　目的 ：了解白色念珠菌的基因分型情况以及不同基因型白色念珠菌的药敏试验结果。方法：应用聚合酶链反应（PCR）扩增白色念珠菌25S核糖体DNA基因内含子区，可转座I型内含子插入片段的数目及大小的不同使得扩增产物不同，根据产物片段大小和数目分型。采用K-B法对不同基因型进行白色念珠菌药敏分析。结果：临床分离的121株白色念珠菌经PCR分为三型：A型83株，B型27株，C型11株。A型为最常见的基因型，B型、C型白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药率显著高于A型菌株，对其他抗真菌药物的耐药率差异无显著性。结论 ：不同型别的白色念珠菌耐药谱可能与特定基因型有一定相关性。 【关键词】 白色念珠菌 PCR 基因分型 药敏分析 　　Abstract: Objective: To understand the situation of genotype and the result of drug susceptibility of Candida albicans isolated. Methods: Polymerase chain reaction (PCR) designed to span the region that included the site of the transposable group I intron of 25S rDNA of Candida albicans ents in the 25S rDNA ethods ain genotype. The results of the antifungal susceptibility testing shoore resistant for azole-drugs than strains of genotype A， no satistically difference ong other antifungal drugs. Conclusion: different types of resistance spectrum for Candida albicans may have a certain relevance to its specific genotypes. 　　Key L美兰的M-H琼脂培养基、YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH6.0（自制）；2%蜗牛酶；原生质缓冲液：1 mol/L山梨醇，0.02 mol/L柠檬酸，0.02 mol/L磷酸氢二钠，pH5.8；SE缓冲液：1 mol/L山梨醇，0.0625 mol/L EDTA，pH 8.0；丹麦ROSCO Neo-Sensitab抗真菌药敏纸片：制霉菌素（NYS）50μg/片，氟康唑（FL）25μg/片、酮康唑（KET）15μg/片，咪康唑（MTC）10μg/片，两性霉素B（AMB）10μg/片，伊曲康唑（IT）8μg/片，由杭州康裕贸易有限公司提供；PCR使用试剂，包括Taq聚合酶以及引物的合成，由上海生工生物工程技术服务有限公司产品；梯度PCR仪（Eppendorf公司）；Bio-RAD凝胶成像及分析系统（gel-Doc2000美国）。 　　1.3 菌株的分离鉴定 　　标本按常规方法分离培养，对临床怀疑真菌感染的标本接种沙保弱培养基，将分离到的酵母样真菌接种于科玛嘉显色培养基，37 ℃孵育48 h，根据生长菌落的颜色作出鉴定，绿色菌落是白色念珠菌，紫色菌落是近平滑念珠菌，蓝色菌落是热带念珠菌。 　　1.4 白色念珠菌DNA的提取 　　取沙保弱平板纯培养的单个菌落接种于YEPD培养基中，35 ℃震荡培养过夜。2 000 r/min离心10 min，弃上清液。三蒸水洗2次。菌体加600μL 2%蜗牛酶溶于原生质缓冲液，30 ℃水浴2 h。3 000 r/min离心10 min，弃上清液。SE缓冲液 400μL悬浮细胞。3 000 r/min离心10 min，弃上清液。沉淀加入450μL TE缓冲液，10% SDS 50μL，65 ℃水浴30 min。加200μL 5 mol/L乙酸钾，冰浴1 h。12 000 r/min离心5 min，取上清液，加等体积无水异丙醇，混匀，-20 ℃静置20 min。12 000 r/min离心20 min，弃上清液。加70%无水乙醇500μL，混匀，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，自然干燥，溶解于50μL TE缓冲液，-20 ℃保存。 　　1.5 白色念珠菌基因分型 　　采用特异引物扩增白色念珠菌基因组DNA的25SrDNA基因的内含子区，以内含子大小