真核表达质粒pVAX1的应用.doc

　　真核表达质粒pVAX1的应用 ：曲云鹏，刘建国，杨德琴 【关键词】 pVAX1；DNA疫苗；质粒 从20世纪90年代DNA疫苗诞生以来，其在医学领域已取得长足的进步和 发展 ，它的出现为预防感染性疾病的发生提供了一种新思维、新方法。但是，目前在DNA疫苗中所应用的载体质粒仅局限于实验室研究和动物实验，如何使DNA疫苗应用于人体实验，最终走向临床研究，是摆在当今广大科研人员面前的关键难题。pVAX1的出现为解决这一难题提供了可能，它是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。迄今为止，关于pVAX1的研究已涉及动物和临床试验，笔者将对其研究现状和应用进展作一综述。 1 pVAX1的基本特性 pVAX1是在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的一种新型真核表达载体，大小为3.0 kb。该质粒用卡那霉素抗性筛选基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性筛选基因，最大程度地减少抗性筛选基因和人类基因组发生重组的可能性。pVAX1含有多个克隆酶切位点允许同时克隆多个大片段的目的基因，强启动子pCMV和BGH poly A信号可以在哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白[1]。pVAX1又是一种非融合载体，要求插入序列中时必须包含一段KozaK的翻译起始序列和一个起始密码子（ATG）以引导正确的翻译，典型的KozaK共有序列为“ANNATGG”，其-3位的A和+4位的G对正确插入甚为关键，在插入序列中还需包括一个终止密码子以正确终止基因表达[2]。 2 pVAX1在人类疾病防治研究中的应用 2.1 肿瘤防治研究 肿瘤在人群中的发病率呈逐年上升的趋势，传统的外科手术加放化疗的 治疗 方法存在组织损伤大、副作用明显、恢复时间长和造成其他组织器官损害等缺点，达不到理想的治疗效果。利用pVAX1为载体，构建可应用于人体实验的肿瘤DNA疫苗是肿瘤预防和治疗的未来发展方向之一。 新生毛细血管的形成为肿瘤提供必要的营养，是瘤体组织生长和转移的先决条件。内皮他定是一种内源性血管生成抑制剂，通过抑制血管内皮细胞的繁殖，抑制毛细血管的形成，达到抑制肿瘤生长的作用。动物实验表明内皮他定能抑制多种肿瘤细胞的生长，并且不具有耐药性和细胞毒性。有学者从重组质粒pGEM-T-EN中扩增出编码内皮他定的基因片段，经EcoR I和Kpn I双酶切后定向插入真核表达载体pVAX1，构建pVAX-sEN，通过瘤体内直接注射攻击肝癌动物模型，3 d后发现癌组织明显变小，用ELISA法在瘤体内检测到pVAX-sEN蛋白表达产物，免疫组化发现肿瘤组织内毛细血管密度明显降低[3]，但治疗效果不尽满意，需作进一步探索。 DNA疫苗治疗恶性肿瘤是一种理想的治疗方式，各种肿瘤细胞表面抗原的多样性要求抗体的广谱性。Konopitzky等[4]在蛋白和mRNA水平比较了正常组织和肿瘤组织，发现钙离子激活氯化物通路2（CLCA2）是大多数肿瘤细胞所共有的抗原。通过RT-PCR可扩增出编码CLCA2主要功能蛋白的基因片段，利用分子克隆技术分别将三段基因克隆到pVAX1，构建多个重组质粒，通过脂质体转染293璄BNA细胞，诱导其在真核细胞中成功表达，为研制新型抗癌疫苗打下了基础。并不是所有的共同多价抗原都适合用于基因疫苗。Smith等[5] 利用PCR技术扩增出编码黑色素瘤多价抗原表位的基因片段，利用分子重组技术与pVAX1结合构建真核表达质粒。通过转染COS7细胞进行体外攻击实验观察到，初次免疫时细胞毒性T淋巴细胞可以产生多种抗体，而再次免疫只能产生一种抗体，提示有免疫耐受现象出现。对于一些组织和发生比较特殊的肿瘤，DNA疫苗也达不到理想的效果。Margot[6]将与肿瘤密切相关的细胞表面黏附分子CD44外显子V2的编码基因，克隆到pVAX1中构建的pVAX1璙2注入淋巴瘤动物模型体内，未在动物体血清中检测到特异性抗体，没有预期的治疗效果，且在胸腺内发现癌转移灶，可能是由于淋巴瘤本身于免疫系统，有着特殊的免疫逃逸机制，并且能诱导机体产生免疫耐受，一般抗原呈递细胞不能将其识别。另外，肿瘤DNA疫苗常常由于给药途径不理想，造成其表达不充分，达不到满意的效果。有学者利用黑色素瘤细胞表面主要抗原蛋白——酪氨酸相关蛋白2(TRP-2)的编码基因，构建真核表达质粒pVAX1-C(SVYD)C和pVAX1-C(TAYR)C，通过电穿孔的方法攻击动物模型，2个月后发现实验组动物肺内转移灶明显少于对照组，或者没有，从脾脏和外周血中获得大量CD8＋T淋巴细胞[7]。该研究成果为探索肿瘤DNA疫苗用药途径提供了新的方法。 2.2 口腔疾病防治研究 牙周炎是世界范围内的疾病，是成年人丧失牙齿的主要原因。牙龈卟啉单胞菌（Pg）是牙周炎的主要病原菌，编码基因rgpA