慢病毒载体导入种蛋内鸡胚技术研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１２）：７３７９ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 技术与方法 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 慢病毒载体导入种蛋内鸡胚技术研究 １ １ ２ １ １ １ 燕海峰 　易康乐 　ＴＲＥＦＩＬＰ　胡雄贵 　邓　缘 　朱立军 （１湖南省畜牧兽医研究所　长沙　４１０１３１　２捷克生物医药研究所　布拉格　２５４４９） 摘要　种蛋内鸡胚含有潜在的胚胎干细胞（ＢＣｓ）或原生殖细胞（ＰＧＣｓ），是目前主要的转基因鸡 研究方法。采用绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的ｐＬｅｎｔｉ６／ｖ５ＤＥＳＴＧＦＰ慢病毒表达载体，白来航鸡与 伊萨鸡种蛋，结合种蛋赤道面开窗专利技术，对含这两种细胞胚的转基因技术进行了比较研究： 转染白来航鸡囊胚，孵化１３天时，ＧＦＰ基因的ＰＣＲ检出率为６４．７％，孵化率极低；转染孵化７２ｈ 伊萨鸡胚血液循环中ＰＧＣｓ，实验蛋孵化率为３５．０％，在出壳后死亡的３只小鸡肝脏中，ＧＦＰ基因 的ＰＣＲ检出率为１００％，存活的４只鸡中有３只在 １２月龄的血液样品中，经ＰＣＲ扩增出了ＧＦＰ 基因；转染孵化７２～７９ｈ白来航鸡胚ＰＧＣｓ，７批次实验的平均孵化率为２１．１％，能在赤道面窗口 注射胚的种蛋比率，以７３～７７ｈ胚龄的最高，为７５．０％～９２．９％，注射病毒组出壳雏鸡血液ＤＮＡ 中，ＧＦＰ基因ＰＣＲ检出率为４４．４％。两种方法比较，ＰＧＣｓ方法在实验蛋孵化率、胚定位在赤道面 窗口率等方面有较强优势。因此为种蛋内胚细胞的转基因鸡技术研究提供了系统、可操作性强 的方法。 关键词　慢病毒载体　种蛋　胚 中图分类号　Ｑ８１９ 　　随着生命科学、制药学和生物医学工程的发展，对 病毒载体系统而可操作性强的方法。 ［１］ 转基因动物生产蛋白的需求会与日俱增 ，由于禽类 １　材料与方法 在转基因生物反应器方面的独特优势，家鸡转基因技 ［２４］ １．１　材　料 术一直是研究热点 。 　　多能干细胞是具有分化出多种细胞潜能的一类细 　　ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶、ＰＣＲ缓冲液、动物基因组 ＤＮＡ提取 胞，家鸡未孵化种蛋胚内含有潜在的胚胎干细胞——— 试剂盒、限制性内切酶等由北京天为时代有限公司提 囊胚细胞（ｂｌａｓｔｏｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓ，ＢＣｓ），孵化一定时期种蛋 供；引物由 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成；慢病毒表达载体 的胚内含有原生殖细胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌｓ，ＰＧＣｓ）以 （ｐＬｅｎｔｉ６／ｖ５ＤＥＳＴＧＦＰ）的构建 以及包装 由本室 ［１］ 及性原细胞。已有报道可通过逆转录病毒载体、慢病 完成 。 毒载体、质粒载体等，经转染囊胚获得高表达量转基因 　　未孵化白来航鸡种蛋（含 ＢＣｓ），孵化７２～７９ｈ白 ［５９］ 来航鸡、伊萨鸡种蛋（含 ＰＧＣｓ）由本单位实验鸡舍 蛋白的蛋清 。目前这些技术，还处在研究阶段。本 提供。 文利用慢病毒载体，白来航与伊萨鸡种蛋，结合种蛋赤 １．２　方　法 道面开窗与封口专利技术，介绍了一套种蛋内导入慢 １．２．１　慢病毒载体转染种蛋内囊胚和发育一定时期 收稿日期：２０１２０８０８　　修回日期：２０１２０８２７ ［１０］