Feulgen反应.docVIP

Feulgen反应了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。DNA可在酸性条件下水解，嘌呤—脱氧核糖之间的糖苷键断开，形成醛基(—CHO)，再用显示醛基的特异性试剂Schiff试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。DNA? 经稀盐酸处理而水解。除可破坏脱氧核糖与嘌呤碱外，还可水解嘧啶碱。酸水解核酸的程度与? 水解时间长短有关，随着水解时间的延长，嘌呤碱基增多，形成的醛基也随之增多，Feulgen反应加强。如果水解时间过长，DNA将完全水解，反而使Feulgen反应减弱。DNA水解时间因组织种类和固定液不同而异，需通过预实验找到合适的水解温度和时间。由于Schiff试剂能与醛基结合，故不能用含醛的固定液固定组织，常用Carnoy固定液。Bouin液不适用于Feulgen反应，因为固定液中含较多的酸，可将DNA水解，影响染色反应。 ??? Schiff试剂是显示醛基的特异试剂，其反应原理是碱性品红(为红紫色)经亚硫酸处理后变为五色Schiff液，Schiff液遇到醛基时，则被还原形成原有的颜色，即红紫色。碱性品红结构中的醌基是碱性品红中具有紫红色的核心结构，经亚硫酸处理后，则醌基两端的双键打开，形成五色品ii-硫酸复合物为Schiff试剂。如果加热使SO2逸出，则恢复品红原来的颜色而失去对DNA的染色效果，故配好的Schiff试剂应避免SO2逸出。 Feulgen反应原理　（一） 仪器、用具　　显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。　　（二 ）材料　　洋葱鳞茎（见图2－1）或根尖（见图2－2）　　（三）试剂　　1．1MHCl的配制　　取82.5ml比重1.19的浓HCl加蒸馏水至1000ml 。　　2．Schiff试剂的配制及保存　　称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1MHCl，冷却至25时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。　　3．亚硫酸水　　取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml 1M HCl，三者于使用前混匀。1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1M HCl中，加热到60水解8～10 min。 2．蒸馏水水洗。 3．Schiff试剂遮光染色30min。 4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。 5．水洗5min。 6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 7．显微镜检查。 　　结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应（见图2－3）。 　　对照片：　　方法一先将材料放在5%三氯醋酸中90水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤1—7制片观察。　　方法二材料不经1N HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤4—7制片观察。结果（见图2－4）1. 对照切片的制做 　　进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。 2. 固定剂的选择 　　以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。 　　但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。 3. 水解时间 　　Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉