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Snapshot技术平台 　　SnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测 SNP 设计的分析软 件和试剂盒可对多个 SNP 位点同时进行基因分型 ,也被称为 minisequencing 。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot 反应后 ,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper 分析 ,可在 一次电泳胶 内检测 多个 SNP位点。这个平台是建立在3730，3130等PCR测序仪上的技术。 3730XL型DNA序列检测仪??? SnaPshot工作原理 应用 SNaPshot 进行定点的序列分析 ,其基本原理遵循了DNA 直接测序中的双脱氧终止法 ,所不同的是 PCR 反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个 SNP 位点的引物 3′端都紧靠SNP点 ,因此每一种引物在聚合酶作用下 ,根据模板的的序列 ,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统 ,检测延伸的那个核苷酸的种类。 1．多重SNaPshot反应的工作原理： 在一个SNaPshot反应体系中， 针对每个待测SNP 位点 在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物） ，引物的Tm 值要求在50度以上 ，在 AmpliTaq聚合酶和 4种不同荧光标.记的ddNTP存在的情况下,各条引物与各自互补的DNA 模板结合, 聚合酶在引物的3’末端延伸单个碱基反应即告终止, 产物的长度为引物长度+1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型 ，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰 。为了能够分辨不同SNP的不同基因型，可在引物的5’末端加上不同长度的Poly C 或Poly T，使各条引物以长度区分。经电泳将其分开。最短的引物一般设定为20bp, 相邻两个SNP的引物之间长度一般相差 4-6个核苷酸，以便区分。 多重SNaPshot反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4种荧光标记的ddNTP 而最终达到 区分不同SNP 位点的作用, 一次反应可以同时对4-5个SNP进行基因分型, 是一种通量较高的基因分型的方法。 图1 SnaPshot实验原理图解 2．多重SNaPshot反应的工作通量 工作的进度取决于多重PCR和EXTENSION的条件优化过程。还有测序仪的通量也是很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出4个位点，那每天的通量就是6000个GENOTYPING，是中等通量的检测。 二.??? SnaPshot工作流程 引物的设计 SNAPSHOT可以检测多重的SNP，我们一般选择4－5个位点做一个组合。现对这些目的SNP进行引物的设计。每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200－500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP,设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。 引物设计注意事项： 同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。 引物与模板互补部分（有效引物）的Tm值至少要50 (C。 为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端的poly(dA)尾巴互补。 引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显著，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距离。当引物长度小于36个碱基时，ABI强烈建议用户使用Primer Focus试剂盒做预实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。 合成长度大于30个碱基的引物时，建议采用HPLC方法纯化。 在引物设计的时候，如果+链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。 进行多重 SNaPshot 反应时 ,需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性 ,对引物的设计要求是尽量保持相近的Tm 值 ,否则会引起非特异性产物的扩增 ,造成碱基误读。另外 ,反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重 SNaPshot 反应相比 ,多重反应不但节省了反应时间 ,还大大减少了试剂用量 ,降低了反应成本。 位点 SNP PCR LEFT PRIMER TM PCR RIGHT PRIMER TM 长度 SNP1 c/t GAGCCAGAGGAGGATGTTGA 60.35 GGCTAGAAGGAGCGAGGACT 60.12 248 SNP2 C/T ACGTTGCAGTTGCCTTTCTT 59.92 GACTCTGCAGTGAGGCCCTA 60.55 210 SNP3