分子生物学常用技术wxk-5基因文库构建6dna测序.pptVIP

分子生物学常用技术 3.1 凝胶电泳技术 3.2 分子杂交技术 3.3 PCR技术 3.4 生物芯片 3.5 基因文库构建 3.6 DNA序列测定 基因组文库构建流程图（λ噬菌体载体） 基因组文库构建流程（粘粒载体） 提高文库质量的措施 1.?双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生 载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG 4. 采用文库快速构建法避免扩增文库时DNA丢失 基因组文库构建和嗜菌斑原位杂交筛选流程图 构建基因组文库杂交筛选、步移克隆全长基因 （六）互套缺失法(系列缺失法) 通过测定一组互套缺失突变体的序列获得目的DNA的全部序列。 基本过程 ①将目的DNA克隆于M13噬菌体中，用两种限制酶（A、B） 切割双链DNA。两酶的切点均在目的序列一端与通用引物结合区结 合。A酶须产生3`凹或平末端，B酶须产生3 `突出末端；②利用核 酸外切酶Ⅲ能够逐个降解具有3`凹陷或平端的双链DNA的5`-单核苷 酸，而3`突出端的双链DNA完全不被其降解的特性，单方面不同程 度的删除目的序列，从而在一组双链DNA上形成不同长度的单链 区；③用核酸酶S1去除两端突出的单链，得到一组双链DNA上形成 不同程度的降解，而载体一端完全保留的单一方向的缺失体；④用 T4DNA连接酶使其自身环化，形成一组大小不同的缺失体，分别转 化宿主菌并加以扩增；⑤利用通用引物测出缺失体中目的DNA约 300bp的序列，最后定向推测出全序列。  2’，3’-双脱氧核苷酸三磷酸；ddNTP DNA测序-双脱氧末端终止法 全自动DNA测序图 4. 不均匀性 在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。 ? 5. 各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）。 3. 代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。 D. cDNA文库在基因克隆应用中的优点  1）无内含子、片段短、易操作。 2）109～107bp，105～104gene，从一较小的群 体中筛选某一特定Gene的工作量较小。 3〕某特定基因在mRNA中的拷贝数＞在基因组 中的拷贝数；并由功能针对性。 4）由于成熟mRNA是转译成蛋白质的直接模板， 可从cDNA序列中直接找到编码区，推测蛋 白质的氨基酸顺序及其性质、功能等。 纯化的蛋白质 制备抗体 氨基酸序列测定 设计寡核苷酸探针 筛选cDNA文库 cDNA序列 已知蛋白质功能 功能结合法 已知蛋白质的 表达差异 比较并寻找差异 表达的DNA片段 蛋白质——基因克隆 1. 载体DNA片段的制备 2. mRNA的分离与纯化 3. 双链cDNA 的合成 1）cDNA第一链合成：反转录法 2）cDNA第二链的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子；DNA聚合酶Ⅰ催化互补合成；SⅠ核酸酶切除单链区域。 3.5.2.2 cDNA文库构建的一般程序 cDNA文库构建——cDNA制备 分离特定组织细胞； （一定发育阶段） 分离纯化总RNA； Oligo(dT)引物； 逆转录合成cDNA； 互补合成cDNA双链。 cDNA文库构建——cDNA制备 人工接头 2）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接 cDNA的定向插入 5. 重组cDNA分子的转移和文库的建立 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为λ载体，则需进行体外包装、感染等。 4. ds- cDNA与载体DNA 相连 1）人工接头：要求具平端ds- cDNA，酶切时可能导致某些cDNA链断裂 双链cDNA甲基化修饰； 酶切位点人工接头连接 cDNA文库构建——cDNA制备 甲基化 人工接头 cDNA文库构建 ——定向插入 3.5.2.3 建立cDNA文库的特殊方法 3.5.