外泌体 Exosome.pdfVIP

Exosome 简介 ，提取 ，分析 （全 ） 一 ，Exosome简介 最近几年 ，一种叫做 Exosome 的小囊泡正受到大家广泛的关注。Exosome 是直径约为 30-150nm ，密度在 1.13-1.21g/m1的小囊泡。Exosome天然存在于体 液中 ，包括血液、唾液、尿液和母乳 ，外泌体(Exosome) 是活细胞分泌的来源于 晚期核内体(也称为多囊泡体 )的膜性囊泡。 Exosome在 30年前被人们所发现。早期的研究认为 ，exosome执行蛋白 运输功能 ，特异靶定受体细胞 ，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。直到 2007 年 ，研究人员发现 exosome也运输核酸 ，参与细胞间通讯。总之 ，其蛋白、RNA 和脂肪成分特异 ，且携带了一些重要的信号分子 ，有望在多种疾病的早期诊断中 发挥作用 ，这使得 exosome 的市场也在快速扩展 ，并成为热门的研究对象。不同 组织细胞来源 exosome 由于携带的蛋白质不同 ，而能够发挥不同的生物学功能。 例如 ，肿瘤细胞分泌的exosome能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸 ；而 树突状细胞源性 exosome则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发 现 ，Exosome 内含有与细胞来源相关的蛋白质 rRNA 和 microRNA ，并且 exosome 能够通过生物屏障 ，在细胞间传递功能性核酸分子 ，从而发挥各种生物学功能 ， 故 exosome有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。 Exosome携带蛋白质 包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与 exosome 的生物 发生和生物学作用有关 ，主要包括 ：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋 白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白 ；另一类是特殊蛋白质 ，这类蛋白质 只存在于某种特殊的细胞分泌 的 exosome ，而这些特定细胞源的 exosome与其 生物学功能有着密切联系 ，例如分子来源的Exosome 上含有 MHCII类分子。 二 ，Exosome提取 Exosome是由活细胞分泌的 ，它是一种亚细胞成分 ，组要成分是磷脂双 分子和携带的膜性分子 ，其界定依据形态学和生物化学及提取方式不同细胞源的 exosome是不同的 ，这些不同的理化性质有利于 exosome 的提取。从体外培养的 细胞中分离和提取 exosome 的主要方法是高速离心法 ，这种方法能分离出大的碎 片和已经死亡细胞 ，然后再通过超速离心法分离 提取 exosome 最后利用糖梯 度 ，使脂质囊性质的 exosome漂浮于上面。具体来说 ，Exosome 的研究方式是分 离/捕获小囊泡 ，并拷问它所携带的货物。就目前而言 ，人们多采用超速离心、 磁珠免疫捕获、沉淀或过滤的方法 ，对 exosome进行前期的分离。之后利用电镜 来分析其大小和形态 ，利用流式细胞仪来 分析细胞表面标记 ，通过 Westernblot 和 ELISA等方法对蛋白进行分析 ，或通过 qPCR和新一代测序 （NGS ）来分析 RNA。调查发现 ，在分离 exosome 时 ，约有 56%的人采用超速离心法 ，说明这种方法仍是目前的金标准方法。不过 ，生物通 之前也介绍过 ，这种方法缺点也不少 ：耗时耗力 ，往往需要 8-30个小时 ；每次 最多只能处理 6个样品 ；需要大量的起始材料 ；产量不高。商业化的 exosome 提取试剂盒已经上市 ，更为简单省事。 1.超速离心法 将欲提取的细胞培养上清液 10ml ，在 4 ℃的环境下 ，300×g 10min ，2000×g 20min ，弃沉淀 ，去除细胞 ；然后 l0,000×g30min ，弃沉淀 ，去除亚细胞成分 ； 再用 10,000×g 60min ，弃掉上清液 ，最后所得沉淀既为 exosome ，用 30mlPBS 溶 液重新悬浮沉淀物 ，混匀后再以 10,000×g 60min ，用 lml PBS溶液悬浮沉淀物 提纯的exosome 溶液分别装入 eppendorf 管内 ，置于-80℃冰箱内保存备用。 2.磁珠 超速离心法既耗时又费力。现在您可以通过使用灵活可控的总外泌小体分 离试剂 ，从不同的起始样本中方便地富集完整的外泌小体。这些试剂及其配套的 试验方案完美适用于广泛的实验计划 ，包括小输入样本量和多种样本处理实 验。从培养细胞中富集的总外泌小体 （使用总外泌小体分离试剂或超速离心 ） 可以通过免疫磁性捕获法进一步纯化为亚组分。可使用基于