(11.29)分子生物学：外源基因的原核表达1.ppt

大肠杆菌表达系统的主要不足 1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程。 2、表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性 3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复杂。 常见的大肠杆菌表达系统 Lac和Tac表达系统：以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。通过对大肠杆菌tac I 基因诱变，获得能过量表达lac I 阻遏蛋白的基因突变体lac Iq，使外源基因的表达调控在一定的水平。此外，目前还构建了阻遏蛋白温度敏感型突变体lac Iq(ts)宿主菌和载体，使lac和tac启动子的转录受温度的控制，在低温(30oC)下基因的转录受到抑制，在(42oC)下基因的转录保持开放。 常见的大肠杆菌表达系统 PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子这间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞中含量的途径很难操作，因此在构建表达体系时，选用温度敏感突变体cl1857(ts)的基因产物调控PL和PR启动子的转录。 常见的大肠杆菌表达系统 T7表达体系：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的，具有很高表达能力的表达系统。T7噬菌体RNA聚合酶能选择性地激活T7噬菌体启动子的转录，这是一种活性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。在大肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体启动子控制的基因在T7噬菌体RNA聚合酶存在下进行高表达。 芽孢杆菌表达系统 芽孢杆菌中高效表达的策略 链霉菌表达系统 基因表达产物的检测与分离纯化 1、多为非致病性微生物 2、培养条件简单，生长迅速 3、表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构象和生物学活性 4、遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作 5、培养发酵技术比较成熟 芽孢杆菌表达系统的不足 1、芽孢杆菌分泌的蛋白酶量大、种类多，对外源基因表达产物的稳定性形成很大威胁 2、载体不稳定，易造成外源基因的丢失 芽孢杆菌表达载体 复制子：目前广泛应用于芽孢杆菌表达载体的复制子有： 1、来源于金色葡萄球菌的复制子如pUB110、pC194和pE194等质粒表达载体。 2、来源于小芽孢杆菌的复制子如pHY481、pWT481等。 芽孢杆菌表达载体 启动子：在利用芽孢杆菌表达体系时，必需使用芽孢杆菌能够识别的启动子。芽孢杆菌含有多种转录起始识别因子(σ)，在芽孢杆菌中已鉴定的σ 已达十种。启动子可被特异的σ 因子识别。芽孢杆菌启动表达具有明显的时序性，与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。 表达载体： 1、自主复制质粒芽孢杆菌的自主复制质粒大多为无抗性标志的隐蔽质粒。带有抗性标志的自主复制质粒主要来自其它革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194，并在这些质粒的基础上构建了双标记质粒等载体。自主复制质粒不稳定，在复制过程中易发生丢失。 2、整合质粒：在大肠杆菌质粒的基础上增加一个芽孢杆菌的抗性标志，以及待整合的目的基因。因其没有芽孢杆菌的复制子，不能自主复制，整合到芽孢杆菌染色体后，随细胞复制而复制。 3、噬菌体：Φ105、SPβ及其它噬菌体均可作为芽孢杆菌的表达载体。其中Φ105是一种温和噬菌体。 宿主菌：野生型芽孢杆菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影响外源基因表达产物的稳定性，因此在构建芽孢杆菌表达系统宿主菌时要将蛋白酶基因进行突变，使其灭活或将活性降低。目前应用较多的宿主菌主要有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。 枯草芽孢杆菌能分泌6种不同的胞外蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金属蛋白酶、杆菌肽酶及中性蛋白酶A和B。对其中3～5种胞外蛋白酶基因进行突变，可将胞外蛋白酶的活性降低至原来的1％；若将6种胞外蛋白酶基因全部突变，则胞外蛋白酶活性可降至原来的0.3%左右。 短小芽孢杆菌表达体系的优点： 1、能对许多蛋白质进行分泌表达 2、胞外蛋白酶活性较低 3、短小芽孢杆菌分泌胞外蛋白酶的同时还能产生蛋白酶抑制剂，不同短小芽孢杆菌分泌抑制剂的能力不同，使胞外蛋白酶的活性差异很大 4、细胞壁的结构由三层组成，最外两层为蛋白层，内层为肽聚糖。细胞壁的结构与细胞的生长周期有关。在生长稳定前期，细胞壁的外层和中层蛋白开始从细胞表面脱落，分泌型蛋白开始表达；进入稳定期后，细胞壁的蛋白层全部脱落，细胞壁蛋白仍然表达导致细胞壁蛋白在培养基中大量累积。 5、利用细胞壁蛋白基因的启动区、操纵区、翻译起始区和蛋白质信号肽序列等元件表达外源基因，可使 外源基因在小芽孢杆菌表达系统中获得高效分泌表达。 1、提高表达质粒