2 RNA 提取,琼脂糖电泳和RT-PCR.pptVIP

实验二 RNA提取、  逆转录PCR;（8：00~8：05）;目的 DNA片段 ;实验二 RNA提取、逆转录PCR ; 总RNA 真核细胞的RNA主要分为： 1、mRNA: 1-5% 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt;RNA提取操作注意事项 ;1）将1 ml Trizol 试剂分装到Eppendorf 管中备用。 2）实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3）将研磨后的组织（小米粒大小）转移至1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4）室温孵育10 min。 ;1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。;RNase抑制剂介绍; ; RNA提取:;8）沉淀RNA：加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000?rpm，4?C，(统一) 离心10 min，弃上清。 10）加1ml 75%乙醇洗涤。 11）7500rpm，4?C 离心 1 min，弃上清 再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。;12）室温干燥3－5 min（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）;13）用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 18 ?l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 14) 吸出 9 ?l溶液放到冰上备用(将用于电泳). 15) 剩余 9 ?l溶液,放到冰上备用（用于RT－PCR）.; ; 按照下列配方进行RNA的RT反应： 第一步： 总RNA 9?l Oligo dT (0.05?g/ml) 1?l (终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65℃水浴10min后， 立即冰浴2min。;RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。; 将 RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 9 ?l RNA 样品 2~3 ?l 上样液轻轻混匀， 上样 电泳: 120伏，10～20分钟 注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果;RNA电泳结果 ; 分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。;第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂： 5?RT-buffer 4 ?l RNasin (40U/ml) 1 ?l dNTPs (10mmol/L) 4 ?l AMV