MicroRNA Let-7b介导甲型流感突变型 PB1重组病毒的构建.pdfVIP

医学研究生学报 2015年7月第 28卷 第 7期 JMedPostgra。Vo1．28，No．7，July，2015 · 683 · 论 著 (基础研 究) MicroRNALet一7b介导 甲型流感突变型 PB1重组 病毒的构建 谭鸣鸣，沈小明，孙文逵 ，夏 迪，施 毅 【摘要】 目的 疫苗是预防流感所致疾病的最有效方法，MicroRNA介导的基因沉默机制为构建新型疫苗提供了新思 路。文中旨在构建包含装载有 miRNALet-7b结合靶位 P日1基 因的甲型流感重组病毒。 方法 比对 A／Nanjing／108／ 2009H1N1的PA、PB1、PB2与let-7b的靶序列选定PBl基因为最优序列后 ，通过基因突变 ，插入 Let-7b的结合靶位；构建 pDP2000重组表达载体，设计pDP—mu—PB1，同时设计对照组pDP—sclb—PB1，并与其余7个质粒共转染 MDCK细胞和293T细 胞拯救病毒 ；留取上清接种鸡胚尿囊腔，血凝法检测病毒 ，TCID。检测病毒滴度 ；提取病毒RNA，采用 RT-PCR扩增病毒cDNA， 通过琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析鉴定病毒。 结果 选择PB1片段最优序列 (位置83bp～107bp)，突变片段改变了3 个氨基酸，同时有3个碱基不能与Let-7b靶序列配对 ；酶切鉴定重组质粒构建正确 ；重组病毒 miRT(miRNAtargetelements)- H1Nl和 scramble(scb1)．H1N1的血凝效价分别为 1：32和 1：64，病毒滴度为4．68×10TCID50／mL和7．94×10TCIDs0／mL；测 序确认突变病毒包含 目的片段。 结论 构建成功重组病毒株 ，为进一步的毒力评估实验奠定了基础。 【关键词】 H1Nl流感；miRNALet-7b；基因重组；反向遗传学 [中图分类号】 R186 【文献标志码】 A 【文章编号】 1008—8199(2015)07-0683-05 【DOI] 10．16571／j．enki．1008．8199．2015．07．003 ConstructionofmicroRNALet-7b-mediatedrecombinantinfluenzaA(H1N1)viurswithmutatedPB1 TAN Ming—ming ，SHENXiao．yue ，SUN Wen—kui，XIA Di，SHIYi (1．DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine，2．DepartmentofInfectionManagement，JinlingHospital， NanjingUniversitySchoolofMedicine／NanfingGeneralHospitalof NanjingMilitaryRegion，P ，Nanfing 210002，Jiangsu，China) [Abstract] objective Vaccinationisamosteffectivemethodforthepreventionofseverediseasescausedbypandemic influenzaandmicroRNA (miRNA)mediatedgenesilencinghasofferedanovelapproachtotheconstructionofnewvaccines．Our studyaimedtoconsturctarecombinantinfluenzaA (H1N1)viurswiththePB1genethatca~iesthetargetfragmentofmiRNA Let-7b． Methods AftercomparingthesequenceoftheA／Nanjing／108／2009H1N1viralfragmentswiththatofLet-7b，we selectedPB1astheoptimalgenesequence，insertedtheLet-7bbindingtargetg