武汉大学病理教研室免疫组织化学的应用IHC通过检测细胞内.PPT

免疫组织化学实验技术 杨飞 武汉大学基础医学院 病理与病理生理学系 免疫组织化学技术的定义 免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内的抗原（或抗体）的分布进行定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原（或抗体），如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。 免疫组织化学的应用 IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。 实验内容 链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法 (Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法) 检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达 实验步骤 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min； 7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵育 15min，甩去多余液体； 10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染； 11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。 实验流程中的注意事项 内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染 染色前处理 －取材、脱水、浸蜡 组织及时固定 固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛 常规下固定8～24小时 取材厚度：2 mm 染色前处理 －预防脱片 常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度 染色前处理 －包埋与切片 包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时（迈新）；或60℃过夜 染色前处理 －切片保存 切片不宜长时间在常温下保存 实验操作中的应用 抗原修复 实验操作中的注意事项 抗原修复 影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类 1）酶消化法 2）加热法（高压法?水煮法?微波法） 抗原修复液的选择 1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0） 内源性过氧化物酶的灭活 存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞 消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟 血清封闭 目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用 冲 洗 一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗 增加效果 可加入Tween20 一抗孵育时间及抗体选择 应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜 检测及显色系统 一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法。如SP、LSABC、ABC等 显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测 显色系统 常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HR