很详细的载体转化计划.docVIP

《PCV-2衣壳蛋白的原核表达》实验计划 1. 实验目的 获得较纯的具有反应原性的抗原，建立间接ELISA方法。为PCV-2单抗杂交瘤细胞的筛选提供方法。 2. 技术路线 ORF2基因片段 质粒载体 酶切 酶切 、连接 重组质粒 转 入 感受态大肠杆菌 挑 斑 获得重组质粒的大肠杆菌 IPTG诱导 纯化 目的蛋白 实验材料与方法 3.1材料 IPTG贮存液（20%，w/v，800mmol/L）：8ml蒸馏水溶解2g IPTG，蒸馏水定容至10ml。0.22um滤器除菌。分装成1ml小份，-20℃贮存。 氨苄青霉素(Amp)贮存液: 按100mg/ml比例将Amp粉剂溶于去离子水中，过滤除菌，分装，-20℃冻存。 X-gal贮存液(20mg/ml): X-gal 20mg溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。 LB液体培养基: Tryptone l0g Yeast Extract 5g NaCl l0g 在1000ml的容量瓶中，称量上述成分，加入去离子水950m1溶解，NaOH调pH值至7.4，定容至1000ml，121℃高压灭菌20min。 LB固体培养基: 琼脂粉1.5g溶于100m1液体培养基中，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右，浇制平板。 Amp/LB液体培养基: 于LB液体培养基中，加入Amp贮存液使终浓度为100ug/ml。 Amp/LB固体培养基: 琼脂粉1.5g溶于100m1液体培养基中，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右，加入Amp至终浓度为100ug/ml，浇制平板。 Amp/LB/X-gal/IPTG平板:在制备好的Amp/LB平板上加40u1 X-gal(20mg/ml)和7u1 IPTG(200mg/ml)，用灭菌L型涂布器均匀涂布于平板表面，37 C温育至完全吸收。 BamHI 酶 XhoI 酶 DNA胶回收试剂盒 T4 DNA连接酶 质粒提取试剂盒 0.lmol/L CaCl2溶液: CaCl2.2H2O 1.47g溶于100m1去离子水中，过滤除菌，分装，-20℃贮存。 甘油 30%丙烯酰胺(w/v): 丙烯酰胺29g, N-N’二甲基甲叉双丙烯酰胺1g，去离子水定容至100ml，pH不能超过7.0，过滤，4℃于棕色玻璃瓶贮存。 1.5mo1/L Tris-HCl (pH8.8): Tris-碱18.17g溶于80m1去离水中，加入约3m1的浓盐酸调pH 8.8，定容至100m1。 lmol/L Tris-HCl (pH6.8): Tris-碱 12.1g,溶于80m1去离水中，加入约7m1的浓盐酸调pH6.8，定容至100ml。 10%过硫酸铵: 过硫酸铵5g，去离子水定容至50ml。 TEMED 5X Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液: 在900m1去离子水中溶解15.1g Tris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml 10% (W/N)的电泳级SDS贮存液，调pH值为8.3，定容至1000ml。 DTT贮存液(1mol/L): 20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09g DTT, 0.22um滤器除菌。分装成小份，-20 C贮存。 2X SDS加样缓冲液: 100mmo1/L Tris HCl (pH6.8) 200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT) 2.0% SDS 0.03% 溴酚蓝 20% 甘油 考马斯亮蓝染色液: 在90m1甲醇:H20 (1:1 v/v )和10ml冰乙酸的混和液中溶解0.25g考马斯亮蓝R-250，用Whatman滤纸过滤，以除去颗粒状物质。 脱色液: 甲醇:冰乙酸:水(3:1:6) 的体积比配成脱色液。 100 mmol/L KC1溶液 0.