光学显微镜的分辨率.PDFVIP

前沿专题报告展示 4Pi 显微镜 演讲：栾德涵 轴向超高分辨率三维显微镜——4Pi显微镜 背景与由来 介绍 原理及结构 内容 分类 应用实例 一、背景与由来 光学显微镜的分辨率： （见书P17 ） n 为物方折射率，u 为物镜孔径角的一半，又叫接受角 弊端 1. 由于衍射极限（夫琅禾费衍射) ，使得传统显微镜 分辨率受限制：XY侧向分辨率200nm、Z轴分辨率 500nm。 2. 电子显微镜虽然能提供纳米级分辨率，但不能观 察活细胞。 因此，对于生命科学的各种应用，改进光学显微镜 分辨率十分重要。 提高分辨率的四种方法 •普通和共焦距显微镜 •干涉方法（4Pi)轴向 •非线性方法（SSIM) •表面方法（TIRF ） 为什需要4Pi？ •科学家需要了解各种微小形态物质的3维结构， 然而传统白光和激光共聚焦显微镜的光斑尺寸无 法达到这样的分辨率。电镜和原子力显微镜虽然 可以提供更高的分辨率，但是只能局限于提供表 面图像，对于活细胞分析无法提供帮助。 •4Pi共聚焦系统的出现完美地解决了这个问题。 来自第14 次课课件 二、原理及结构 原理（干涉方法） 4Pi是空间立体角的数值。 立体角（符号Ω ）：以圆锥体的顶点为球心，半径为1的球 面被锥面所截得的面积来度量的，度量单位称为“立体弧度 ”。 公式：曲面上面积微元ds 与其矢量半径的二次方的比值为此 面微元对应的立体角记作dΩ=ds/r^2；由此可得，闭合球面 的立体角都是4π。 球面度（符号sr）：立体角的国际单位。 它可算是三维的弧度。。 例如一个球的球面度是4π， 一个椭球的球面度是4π。 由瑞利数据可知， 增加物镜的接受角u （等效增加物镜的NA ）， 可以减小PSF( 点扩散函数) 的尺度从而提高分辨率。 4Pi工具扫描显微镜利用这一概念，通过样品前后的双物 镜使总的接受角接近4Pi ，进而提高NA值。 1992年，hell制造出4Pi显微镜 1998年，将专利卖给Leica Leica推出商用4Pi显微镜，并获 得2005年德国技术与创新奖 结构特点 摘自中国显微图像网 基于干涉原理的4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有 公共焦点的物镜，通过2种方式获得高分辨率的成像： ①样品由两个波前产生的干涉光照明； ②探测器探测2个发射波前产生的干涉光； 4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出 小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显 微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞 的超高分辨率成像。 三、分类 •单光子4Pi共焦扫描显微镜 •双光子4Pi共焦扫描显微镜（看得深） •多焦点多光子4Pi共焦扫描显微镜（MMM-4Pi ）（速度快）