分子技术--幻灯片.pptVIP

按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。 Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。 由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。 纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； OD260值=1，相当于单链DNA或RNA为40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。 寡聚（dT）-纤维素柱层析法利用mRNA 3′端含有Poly（A+）尾巴 的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 Real time PCR 常用方法 1、非特异性荧光染料掺入法 常用染料：SYBR Green I 基本原理： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而自由的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 SYBR l SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ Taq Taq 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR l l l l l 优点：① 通用性好，只需要设计PCR引物。 ② 方法简便，省时，价格低廉。 缺点：由于荧光染料和模板的结合是非特异性的，可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，不能有效区分目的双链DNA和非目的DNA分子，所以有时不能真实反映目的基因的扩增情况。 方法的优缺点： 2、特异性荧光探针法 特异性的荧光探针法是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测。 TaqMan荧光探针： TaqMan探针是一段与模板DNA部分序列完全互补的寡核苷酸，其5′端标记报告荧光基团（R），3′端标记淬灭荧光基团（Q）； 5’ 3’ R Q Probe 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 。 l 5’ 5’ 3’ 3’ dNTPs Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 加样 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应管 Taq l 5’ 3’ R Q Probe 5’ 3’ R Q Thermal Stable DNA Polymerase Taq 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ R Q 延伸 1、链的合成起始 Taq 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ 2、切割和链置换 3、链合成结束 5’ 3’ Q Taq R 3’ 5’ 4、检测 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ l 5’ 3’ 5’ 3’ Q R 退火 五、基因组DNA文库的构建 基因组DNA文库 （Genomic DNA library）: 是指将某种生物的基因组DNA用限制性内切酶或机械切割法切成适当长度的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞，形成克隆。汇集某种生物全部遗传信息（基因组DNA中所有序列信息）的重组DNA分子的克隆总和，就称为该生物基因组DNA文库。可用于保存某种生物的全部基因、分离特定的基因片段和全基因组序列测定、分析 等。 构建基因组DNA文库需考虑的问题