《植物生物技术导论》实验指导.docVIP

《》实验 实验一 植物培养基的制备与灭菌 一、实验目的 1、在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取一定体积的母液即可。通过本实验，学习和了解培养基母液的配制方法。 2、掌握培养基的配制方法。 3、学习和了解培养基、器皿和相关设备的灭菌方法。二、主要实验用具和仪器设备 烧杯（1000ml、500ml、100ml、50ml）、量筒（2000ml、1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml、10ml）、容量瓶（1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml）、试剂瓶（1000ml、500ml、200ml、100ml、50ml）、玻璃棒、油性标记笔、移液枪（5ml、1ml、200μl、100μl）、对应的枪头、培养基瓶（1000ml、500ml、200ml）等。 电子天平（感量为0.1mg、10mg）、pH计、灭菌锅、微波炉、磁力搅拌器、电磁炉、超净工作台等。三、实验药品 按培养基配方准备。1N NaOH、1N HCl。四、实验内容（一）MS培养基母液的配制 1、大量元素母液的配制（配1L） 无机盐中大量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，分别用50ml烧杯称量，用蒸馏水溶解，必要时加热。溶解后，倒入1000ml容量瓶中，最后用蒸馏水定容。在混合定容时，必须最后加入氯化钙，因为氯化钙与磷酸二氢钾能形成难溶于水的沉淀。将配好的混合液倒入细口试剂瓶中，贴好标签。配制培养基时，每配1000ml培养基，取大量元素母液100ml。●7H2O 370 3.7 CaCl2●2H2O 440 4.4 2、微量元素母液的配制（配0.5 L） 无机盐中微量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大100倍，分别用50ml烧杯称量，用蒸馏水溶解，必要时加热。溶解后，倒入500ml容量瓶中，最后用蒸馏水定容。 化合物名称 每升培养基用量 （mg/L） 扩大100倍称量 （mg/0.5L） 备注 MnSO4●4H2O 22.3 1115 每升培养基取母液10ml ZnSO4●7H2O 8.6 430 H3BO3 6.2 310 KI 0.83 41.5 Na2MoO4●2H2O 0.25 12.5 CuSO4●5H2O 0.025 1.25 CoCl2●6H2O 0.025 1.25 3、铁盐母液的配制（配0.5 L） 目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。常常配成200倍母液，溶解时可加热。 化合物名称 每升培养基用量 （mg/L） 扩大200倍称量 （g/0.5L） 备注 Na2EDTA 37.25 3.725 每升培养基取母液5ml FeSO4●7H2O 27.85 2.785 4、有机物母液的配制（配0.5 L） MS培养基中，有机物为甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫氨素（V-B1）、盐酸吡哆素（V-B6），常常配成1000倍或100倍母液。本实验将有机物配成100倍母液。 化合物名称 每升培养基用量 （mg/L） 扩大100倍称量 （mg/0.5L） 备注 Glycine 2.0 100 每升培养基取母液10ml Thiamine-HCl 0.4 20 Pyridoxine-HCl 0.5 25 Nicotinic acid 0.5 25 Inositol 100 5000 母液倍数或 浓度（mg/ml） 配制1L培养基所需量 配制培养基所需母液量(ml)或直接称量量（g） MS-1MS-2 (0.7L) MS-3 (0.7L) 大量元素 20倍液 微量元素 200倍液 铁盐 200倍液 有机物质 200倍液 2,4-D 1.0 mg/ml ml —— NAA 1.0 mg/ml ml —— —— KT 1.0 mg/ml ml —— 蔗糖 30 琼脂 8 —— pH值 6.0 6.0 6.0 × 1 cm大小、茎或根切成5 mm- 15 mm长的茎段或根段，然后将外植体接种到固体培养基表面，25(C下，暗培养。 （四）愈伤组织诱导的观察：每隔一段时间（2-5天）观察并记录烟草愈伤组织在外植体上的形成，愈伤组织的生长动态，愈伤组织的颜色，污染情况。 （五）愈伤组织的继代培养：小心将诱导形成的愈伤组织从外植体上分离，转到新鲜的培养基（如MS-1培养基）上，经过5-7次继代培养，可获得生长迅速、质地疏松的烟草愈伤组织。诱导