地中海贫血的诊断方法.docVIP

地中海贫血的诊断方法 B-地中海贫血的筛查和诊断主要依赖实验室检查，方法主要有： 1 血常规检测 地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血，如MCV≤80 fl，MCH≤25．0 Pg，则可疑为地中海贫血患者或基因携带者 ，可同时测定血清铁和铁蛋白，以排除缺铁性贫血。 2 红细胞渗透脆性试验(一管法) 其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展，膜与内容物之比增大，对渗透溶解的抗性增加，在0．32％(或0．36％)NaC1中溶解度降低(脆性降低)。一管法可用于地中海贫血群体筛查。 3 血红蛋白(Hb)电泳Hb电泳 是检测地中海贫血、异常血红蛋白最常用的方法，可观察到HbE、HbH等异常血红蛋白区带，同时可定量检测HbF、HbA2的含量并区分常见类型的地中海贫血。有研究显示MCV、Hb电泳和红细胞脆性实验三者联合检测的灵敏度可达100％ ，阴性预告值达100％ ，联合特异度可达100％ ，阳性预告值达100％DS。 4 高效液相色谱技术(HPLC) 原理：采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术，全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型，容易发现重型和轻型B地中海贫血。在操作上，HPLC采用的是全血标本，不需要制备Hb液，只要将全血标本直接放在仪器上，通过电脑操作便能实现HbA、HbA2、HbF等定量检测。优点：所需样本量少，自动化程度高，操作简单，快速，能消除人为误差，结果准确。HPLC也可用于胎儿脐带血的产前诊断，可诊断出重型B地中海贫血，但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿 。近年来，地中海贫血高发地区也采用此法进行携带者检测 。 5 基因诊断 近年来，随着分子生物学研究领域的不断发展，从最初的B珠蛋白基因簇限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应(PCR)技术结合其他分子生物学方法，B地中海贫血的诊断已逐步改进和完善。基因诊断方法有下列几种： 5．1 限制性片段长度多态性连锁分析(RFLP连锁分析) 原理：DNA限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸序列，得到一定长度的DNA片段，而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成，从而改变酶切片段的大小。突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可判断出突变是否存在。缺点：由于单独使用该方法，不能直接测出受试者突变基因的类型，必须结合寡核苷酸探针等技术，故其应用范围有一定限制，且操作繁琐。如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合子，无法用此方法进行产前诊断，或者患儿和父母所有位点上都是杂合状态，只能进行50％ 的排除性诊断。 5．2 探针斑点杂交技术(allele—specific oligonucleotide ASO) 应用引物扩增珠蛋白基因，同时合成与正常序列和突变序列完全互补的寡核苷酸探针。将PCR扩增产物点在尼龙膜上，分别与标记的正常和突变的ASO探针杂交，不完全互补的探针，在一定条件下可以完全洗脱，再从放射自显影观察杂交结果。如果两个等位B珠蛋白基因正常，仅与正常探针杂交，反之，均带有突变时，则仅与突变探针杂交。这种检测方法快速、灵敏。缺点：对DNA的纯度和数量要求较高，一次杂交能检测一种突变，对于具有高度异质性的B地中海贫血往往需要多次更换探针杂交，才能确定诊断，如使用同位素标记探针，还存在放射性污染等问题。 5．3 反向点杂交方法(Reverse dot blot hybridization，RDB) 与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基本原理相同，所不同的是：将膜上固定探针取代固定靶DNA，经一次杂交就可对未知样品中多个突变进行检测，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的方式。优点：较快速、敏感，操作简单。缺点：只能检测已知位点突变的B地中海贫血，不能检出未知突变。 5．4 缺口PCR(gap PCR) 原理：设计三个或两对引物，即在缺失区域外侧，靠近缺失位点的位置设计一对引物，另外一个或一对引物在缺失区域内。在缺失区域内的引物能够在杂合子和正常人中扩增出片段，在缺失纯合子中不能扩增。在缺失区域外侧的一对引物，因为缺失使相距甚远的两端DNA拉进，从而可扩增出特定的DNA片断。从而检测出纯合子患者，杂合子携带者。Wang等 报道用此方法对89个B珠蛋白基因突变的检测。 5．5 扩增不应突变系统(amplification refractorymutation sys—tems，ARMS)或称等位基因特异性PCR 原理：在PCR中，针对某个点突变设计出3端碱基与目的基因的突变碱基互补的引物，PCR反应中，只有突变的基因才有相应的扩增产物，而正常的基因则不能扩增 。从而将正常与突变的DNA区别开来。优点：仅需微量的DNA