基于rna-seq数据的剪接点分析软件.docVIP

题目：基于RNA-Seq数据的剪接点分析软件及应用 名词理解： RNA-Seq：是转录组测序技术，就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。 样品提取总RNA后，对于真核生物，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，对于原核生物，用试剂盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq2000进行测序。 数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。全基因组分析：可以对任何物种进行全基因组分析。无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。 rRNArRNA即核糖体RNA，是细胞中含量最多的RNA，约占RNA总量的82%也是3类RNA（tRNA,mRNA,rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”rRNA的分子量较大，结构相当复杂，目前虽已测出不少rRNA分子的一级结构，但对其二级、三级结构及其功能的研究还需进一步的深入。原核生物的rRNA分三类：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四类：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。S为大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可间接反映分子量的大小。原核生物和真核生物的核糖体均由大、小两种亚基组成。在人基因组的四种rRNA基因中， 18S、5.8S和28S rRNA基因是串联在一起的，每个基因被间隔区隔开，5S的rRNA基因则是编码在另一条染色体上。 　　核糖体RNA在各种生物中都有其特性，因此可以从不同生物的rRNA的对比中得出关于生物进化历程的结论。rRNA为肽酰转移酶(peptidyl transferase)时，催化使肽键形成，不需要额外的能量。过去认为，大亚基的蛋白质具有酶的活性，促使肽键形成，故称为转肽酶。20世纪90年代初，H.F.Noller等证明大肠杆菌的23SrRNA能够催化肽键的形成，才证明核糖体是一种核酶，从而根本改变了传统的观点。核糖体催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA构象，起辅助的作用。 Oligo(dT)多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。1.oligo(dT) capture ：因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。 2.反转录（RT-PCR）因绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物所得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。但是在反转录从mRNA获得cDNA时，也可以用随机六聚体引物和特异性引物。 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 cDNA：互补DNA（Complementary DNA