蛋白质多肽等大分子的质谱分析.docxVIP

蛋白质、多肽等大分子的质谱分析检测仪器:1、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF?MS)2、基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱(Autoflex III MALDI-TOF/TOF)3、纳升液相电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪(micrOTOF-Q II? ESI-Qq-TOF)主要应用:1、生物大分子的分子量检测2、蛋白质、多肽的纯度鉴定3、蛋白质的肽指纹图谱检测4、混合组分的分子量分布检测5、合成物质的分子量检测与纯度评价6、重组蛋白的分子量检测与纯度评价7、蛋白质的多肽谱检测8、血清多肽谱的检测9、PEG修饰的蛋白药物的研究?样品要求: 1、样品含量: 50-100Fmol (液体约5ul)2、样品形式: 液体；干粉；胶粒/条带3、非胶样品: 挥发性盐20mM，无PBS、SDS和尿素等物质4、胶类样品: 银染过程中未使用戊二醛作为固定剂5、保存方式: 液体建议低温，胶类用去离子水防干蛋白质及多肽质谱鉴定简介　　博奥生物有限公司蛋白质实验室于2006年开始对外提供多肽和蛋白质测试服务，包括多肽和蛋白质的分子量和序列测定，蛋白种类鉴定。博奥采用串联质谱法（Tandem Mass Spectrometry, MS/MS）鉴定蛋白，可靠性高。蛋白经胰酶消化形成的肽段进入质谱，一级质谱检测多肽分子的大小，然后再将肽段打碎，形成一系列离子即N端离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列）。质谱再检测碎片离子的大小，即二级质谱。将质谱数据与蛋白数据库进行比对，获得肽段的序列，特定的多肽序列对应着特定的蛋白，从而鉴定出待检测蛋白。除了鉴定单个蛋白，我们的液相色谱和质谱联用平台（Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）还具有分析混合蛋白的能力。MALDI-TOF MS（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）是另一种常用的质谱平台，通过肽指纹图谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）来鉴定蛋白质。MALDI-TOF MS的鉴定结果没有没有氨基酸序列信息，最终得到的是蛋白数据库多个质量相同或相似的候选蛋白列表，相对而言可靠性较低，并且MALDI-TOF MS无法鉴定混合蛋白。服务流程1.单个蛋白鉴定A)用于鉴定纯化的单个蛋白的溶液或粉末，或经过SDS（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）的单个条带或二维电泳的单个点。B)蛋白酶解成多肽。C)液相分离多肽，离子化的多肽进入质谱，母离子检测，母离子裂解成一系列子离子，子离子检测。D)数据库检索。E)人工验证，输出报告。2.蛋白混合物的鉴定A)用于鉴定含多种蛋白的混合物，根据样品的复杂程度采取不同的策略分离后再进行质谱鉴定。3.差异蛋白分析A)相对定量：比较两组细胞/体液中的蛋白，找出差异蛋白。?服务优势采用真正的纳流液相系统，具有更高的灵敏度。串联质谱，提供序列信息，蛋白鉴定可靠性高。采用LC-ESI-MS/MS（Liquid Chromatography Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectrometry）配置，适用于复杂样品。鉴定实例　　图2为不同量Apomyoglobin蛋白（Sigma，A8673）SDS图。将电泳后的蛋白条带切胶，酶解后使用我们的液相色谱和质谱联用平台检测，结果如表1。质谱结果显示的是红色箭头所指示的位置切下的胶条（32ng）的鉴定结果。即使是考马斯亮蓝染色微弱的条带，仍能得到很好的质谱鉴定结果[表1]。???图2 Apomyoglobin蛋白电泳图表1 质谱鉴定Apomyoglobin蛋白条带（32ng）结果ReferenceScoreCoverageMWAccessionPeptideMyoglobin[Equuscaballus]90.2749.3517072.0255683511139 质谱分析的目的主要是确认分子量，当然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是这个需要比较全的数据库作为基础，分析才能比较准确。由于多肽性质不稳定，需要采用软电离技术，目前多肽分析主要是使用电喷雾（ESI-MS），基质辅助激光解吸（MALDI_MS）其中电喷雾可以给出多电荷峰，电荷数目和多肽序列上的氨基，胍基，咪唑基的数目有关，因此，经常给出了双电荷，三电荷等离子峰。MALDI_MS可以分析蛋白大分子，而且通常情况下很少带多电荷，因此数据直接对应了分子离子峰，容易分析。此外，通常在分析长肽或蛋白质过程中，需要添加