rna干扰(rna interference ,rnai)的研究进展.docVIP

RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。 一．RNAi的发现 早在1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现,将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响,并将这种现象称为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脉孢菌属(Neurospora) 中发现了相似现象,只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用(quelling) . 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par－1 基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par21基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA 作为对照,也同样阻断了基因的表达。这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA ——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA 不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为RNA 干扰。 过去认为, 哺乳动物细胞中不存在RNAi 现象,因为较长的dsRNA 在哺乳动物细胞中能诱导IFN(干扰素) 生成,并激活STAT 途径参与的PKR(dsRNA 依赖性激酶) 的转录,同时dsRNA 本身与PKR 结合也能令其激活,继而磷酸化翻译起始因子eIF2a 使之失活,导致非特异性的蛋白质合成障碍;另一方面,dsRNA 又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶,生成 2′,5′腺苷酸,激活非特异性的RNA 酶L ,发生非特异性的RNA 降解效应。现在发现, 只要dsRNA 短于30bp ,就不会促发干扰素效应,同时又能特异性地降解mRNA ,引起基因沉默,说明dsRNA 在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用,为以后的基因治疗等RNAi 应用领域提供了新的研究方向。 ? 二．RNAi的作用机制 近年来研究发现,干扰性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类长约21～25 个核苷酸( nt ) 的特殊双链RNA(dsRNA) 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基. 此外,每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基RNAi 的主要过程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干扰性小RNA ( siRNA) ,由siRNA 介导识别并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 细胞中dsRNA 可通过多种途径形成,如基因组中DNA 反向重复序列的转录产物;同时转录反义和正义RNA ;病毒RNA 复制中间体;以及以细胞中单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在线虫( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌获得dsRNA. 现已初步阐明RNAi 的作用机制. RNAi 的第一步是,dsRNA 在内切核酸酶(一种具有RNase 样活性的核酸酶) 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA.果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在Arabidopsis , C