凝乳酶消化和自动对焦技术产生新型的抗菌乳铁多肽.docVIP

凝乳酶消化和自动对焦技术产生新型抗菌乳铁多肽 生物090何丽娟 1 研究背景 通常采用如巴氏灭菌法、冷冻、罐头、气调包装或加入食品中的化学防腐剂的食品保鲜程序，以防止可能导致人类疾病或食品变质的微生物生长。化学防腐剂如亚硝酸盐、苯甲酸、山梨酸、亚硝酸盐，已被广泛有效地利用到食品的做法中（Deng，2006；Seman，Quickert，Borger，Meyer，2008）。现在由于消费者的偏好，食品行业对天然抗菌剂产生了相当大的兴趣。所以，制造商正在敦促发展一个建立在天然化合物基础上的维护系统。 乳铁蛋白是一个著名的天然抗菌蛋白，作为天然食品防腐剂吸引了相当大的作为转家族的成员，LF是一种阳离子蛋白，存在于很多分泌物，包括奶、眼泪、唾液或血清（贝米拉等，1993；Chantaysakorn Richter，2000）。乳铁蛋白是一个约78KDa的单链分子，两叶组成4个部分促进两个铁离子的可逆结合。因此，LF的抗菌作用是在微生物中限制铁的获得可用（Dionysius, Grieve, Milne, 1993; Ye,Wang, Liu, Ng, 2000）。即便是在高浓度的情况下，它的抗菌活性的限制也是通过它的抑菌活性来限制的。此外，在低PH值时，高温高盐条件下，不太方便经常将天然蛋白作为可变性或沉淀蛋白用于食物保险，这会失去其活性。 乳铁蛋白被猪胃蛋白酶消化后的LF多肽比完整的乳铁蛋白表现出更高的抗菌活性。根据消化情况，从人和牛LF分别获得从11至47个和6至25个氨基酸残基的不同长度的不同抗菌肽。这些抗菌肽被称为lactoferricin H 和lactoferricin B。LF-CIN的抗菌作用已被公认，通过革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的细胞膜不稳定，造成破坏细胞膜的通透性（Ulvatne，Haukland，Olsvik， Vorland，2001；Vorland，Ulvatne，Rekdal， Svendsen，1999）。此外，LF-CIN B已经表现出一些生物活性免疫和抗癌作用（Tomita，Wskabayashi，Yamauchi，Teraguchi， Hayasawa，2002；Wakabayashi，Takase， Tomita，2003）。 已被用于产生LF-CIN的猪胃蛋白酶，因为伊斯兰社区的宗教规则而不能使用。因此，非猪原产地没有食品级胃蛋白酶的商业产品，与此同时，其他蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶，植物和微生物蛋白酶进行了研究，但显著抗菌肽无法从低频产生。 凝乳酶酶，目前在小牛凝乳酶中与胃蛋白酶有一些共同特点。但是，它没有详细说抗菌肽在乳铁蛋白中在PH为6时的特点。其它的消化条件没有测试。此外，食品级凝乳酶和小牛凝乳酶为市场和世界各地消费者所接受。因此，目前的研究目的是探讨是否任何抗菌肽都可用在乳铁蛋白与小牛凝乳酶或凝乳酶消化后表达。得到的结果与在乳铁蛋白与猪胃蛋白酶和微生物凝乳酶消化后比较。自动对焦和色谱技术用于分离和鉴定活性肽。 2 材料和方法 2.1 菌株和培养条件 培养液用接种环接种到TSA里培养，30℃过夜培养平板，然后挑取单菌落接种到10毫升的TSB中。接种过的TSB在30℃下培养16-20小时，再将0.5毫升传代TSB菌液接种到新鲜的10毫升TSB中，继续培养6小时。菌液中加入5毫升PH7.4的0.07摩尔每升的PBS。以3000g转离心10分钟收获菌株，漂洗并重新在TSB中悬浮。在用于试验前，后面得到的培养液要用1：10的新鲜TSB稀释。 2.2 乳铁蛋白水解液的准备 牛乳铁蛋白（LF）从wake pure chemicials公司获得。胃蛋白酶（EC3.4.23.1）、小牛凝乳蛋白酶（EC3.4.23.4）和微生物肾素来自于毛霉菌（EC3.4.23.6）是由美国sigma-aldrich公司提供。 乳铁蛋白水解液是用ballamy,takase,wakabayashi,kawase,tomita的方法准备的。简单地说，牛乳铁蛋白用无菌蒸馏水溶解，浓度为5%，然后用1摩尔的盐酸或者1摩尔的氢氧化钠调ph值到3.0或者6.0.酶的终浓度为3%。混合物在37℃下培养4小时。在80℃下水浴20分钟终止反应。缓冲液的PH值用1摩尔的氢氧化钠调至7.0.不溶性的固体物用6000g的转速离心下来。悬浮液冻干后用于下面的实验。 2.3 抗菌多肽的纯化 2.3.1 多肽的自动对焦 LFH中的多肽首先用自动对焦技术分馏出来，这是基于样品肽的两性性质来制备等电聚焦。自动对焦参数在PH梯度的基础上收集、瓦解、冷冻干燥，然后在胰胨大豆肉汤培养基（TSB）上作抗菌测试。 2.3.2 体积排阻色谱法（SEC） 将在自动对焦分数最高的抗菌活性肽溶于含0.1％三氟乙酸（TFA）浓度