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微生物基因敲除技术分析 牟福朋 20071401105 山东大学生命科学学院 摘要：基因敲除技术是上个世纪80年代出现的新型分子生物学实验技术。到现在经过近30年的发展，已经出现了很多前沿技术。微生物由于它本身特有的性质一直成为基因敲除的热点。本文主要考察基因敲除技术的现状及其发展方向，并对基因敲除的应用提出自己的观点。 关键词：基因敲除 微生物 前沿进展 一 常规基因敲除 1 常规基因敲除的步骤 基因敲除的一般流程见图1。用引物扩增目的基因之后，使用内切酶切开基因，连入有相同粘性末端的抗生素基因如四环素抗性基因或者报告基因例如lacZ等；将载体转化入目的菌内，通过筛选，筛选出含有标记基因的菌株，然后要通过PCR等进行复证。 使用双标记法可以判断发生交换的次数。如果只发生第一次重组，则两个标记都会被插入宿主DNA中；而若发生了两次重组，则阴性标记会被丢失，细菌要么是野生型的，要么能检测到阳性标记。 图1 常规基因敲除的主要流程和机理 2 常规基因敲除的成功率分析 首先，DNA的同源重组频率不是很高。况且，此处要求发生两次同源重组，这使得重组概率大大下降。加长两端的同源序列有助于重组，但这样一来内切酶效率就得不到保证。这一问题解决的方法，主要是进行大量的培养，实验中，往往可以得到较多的敲除子。 第二，图中可以看出，在第一次重组和第二次重组之间，由于敲出基因载体的整个插入，基因仍然有一部分是完好的（载体的一段和宿主的另一端融合而成）。解决这一问题的方法已如前述：即引入两个标记。 3 常规基因敲除的主要缺点 ①速度慢，效率低。基因敲除需要一般的基因工程方法来进行转化和表达，周期较长，在这个过程中载体是关键； ②对细胞感受态要求较高。基因敲除和普通基因工程相比，有一定的不同：因为目的基因必须采用特殊载体装载，保证转化率很关键。对于这一点，现在可以采用基因枪法或者电转化来解决。 ③基因敲除对于酵母、丝状真菌等真核微生物研究较少，主要原因是对于一般的转化方法，对于真核生物转化不容易；而且在真核生物中，表达周期要更长，因此效率要更低；真核生物基因调控的手段很复杂，即便是进行了敲除之后，由于某些原因，可能并不表现一定的形状，导致敲除失败。 二 常规基因的改进方法 1 基因捕获 基因捕获是功能基因组学的研究方法，本来应用于表达基因的寻找。但它本身的操作方法可以用来构建基因敲除体系。它的主要机制如下图所示。 图2 基因捕获的机制 以带有报告基因的基因捕获载体转化到细胞中。由于这一序列本身不含有启动子，所以只有转化到有启动子的（能够表达的）DNA序列上，也就是只有转化到基因里，才能够表达报告基因。结合cDNA文库和DNA芯片，由此便可以报告一个功能基因的位置。 如果采用大量的转化载体和大量的细菌细胞进行实验，则可以得到很多随即插入序列的不同细胞。类似于CDNA文库那样，这一系列的细菌便可以作为一个体系。 因此，基因捕获也可以当做基因敲除文库来使用。原核生物，例如大肠杆菌，功能基因的数量远不如真核生物多。因此，原本用于真核生物的基因捕获在原核生物的应用就变得特别容易。现在，已经得到了基因捕获体系的大肠杆菌文库，可以进行很多细菌分子生物学实验和分析。 2 基因捕获的优缺点 基因捕获的主要优缺点是并存的，那就是它只能够敲除表达的基因（事实上是所有基因都能被敲除，但是只能够报告出表达的基因），这一方面为筛选带来了方便，另一方面又难以对深入的调控问题做研究。 3 线形转化敲除法 1998年,Murphy等报道了利用λ噬菌体的线性Red同源重组系统获得高重组率。Red系统主要包含3种蛋白质分子,分别称为Exo、Beta和Gam，这三者是λ噬菌体中的高效重组蛋白质。采用这样的转化体系时，宿主DNA被直接切断，转化基因直接插在切口中。因此，这种转化效率是很高的，可以用来弥补基因敲除需要两次重组的低效率。 线性转化进行基因敲除的方法还有一个有点就是需要的同源序列很短，只有50-60bp，可以进行人工合成，繁琐的酶切和连接。 此外，尚有结合转化敲除法以及温度敏感型质粒敲除法等，转化效率和实验进行速度都比常规敲除有了很大提高，更适合于微生物场合下的基因敲除。新兴敲除技术的出现使得微生物分子生物学研究处在了新的历史舞台上，结合微生物研究本身的特点，一定能够成为新知识、新技术的诞生地。 三 特殊场合的基因敲除技术 1基因条件敲除技术 基因条件敲除可以研究某些基因在微生物发育的不同阶段，或者不同的生长时期的表达情况，或者在发育生物学中进行基因表达的研究。关于这方面的技术，目前有报道的还很少，但是这种技术在研究实践中一定有很广阔的应用前景。目前，对基因的条件敲除技术有一些报道。他们主要应用的基因敲除体系是四环素诱导的基因敲除方法。 图3 基因敲除的四环素诱导法。 将tTA整合到