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内 容 StepOneTM荧光定量PCR检测系统介绍 系统安装条件 培训所需试剂设备及样品 培训程序及时间安排 实验操作流程 软件使用培训 常见问题解答 八、软件及主机常见问题处理 一、StepOneTM荧光定量PCR检测系统介绍 1.1 简介 美国Applied Biosystems公司拥有PCR以及定量PCR技术的双重专利，一直以来致力于PCR技术的开发和应用。StepOneTM是Applied Biosystems公司推出的第四代荧光定量PCR检系统，这套系统除了秉承Applied Biosystems公司荧光定量PCR仪一贯稳定的性能，以及精确、可靠的结果保证外，还配备了最新一代易于操作的定量分析软件，同时可以通过触摸屏实现对仪器的控制，使用者还可以通过远程网络进行仪器监控，这些功能，都使得荧光定量PCR实验变得前所未有的方便。正是得益与其高度灵活性和易用性，甚至对于先前从未有过实时定量PCR经验的科研人员来说，也非常有信心设置和操作StepOne扩增仪。2007年StepOneTM还获得了SelectScience评选的2007年度最佳生命科学新仪器奖Applied Biosystems公司专利的多组分算法，保证了检测装置能方便无荧光污染的进行检测。同时配备波长范围较宽的滤光片，可以收集更多的光信号，提高了信噪比和灵敏度。 图1-1：专利的多组分算法 1.3 光学模块 StepOneTM采用蓝色高功率的光子发射二极管（LED）和高灵敏度的PDT来来激发和检测三种不同的光谱。LED由于是单一波长激发，荧光信号强，消耗低，稳定，寿命长，可以连续使用40年； PDT灵敏度高，逐一检测避免了样品间的荧光干扰。同时，StepOneTM独特的ROX参比染料提高了数据的精确性。 图1-2：参比染料ROX均一化前后数据结果比较 1.4 PCR反应模式 StepOneTM使用一个加热模块，两种加热模式：标准循环模式和快速循环模式。快速循环模式可以在40分钟内完成40循环。更快的升降温，不仅缩短了反应时间，更有效地避免了非特异性结合，提高了PCR反应的特异性。StepOneTM系统支持10-30μl的反应体系，大大节省了实验损耗。 图1-3：不同升降温体现不同的PCR反应特异性 1.5 PCR反应精确性 StepOneTM不仅具有宽广的动力学范围（至少8个），而且精度很高。对于2倍差异模板的区分，可信度可以达到99.7%。StepOneTM荧光定量系统稳定，重复性很好。 二．系统安装条件 位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射 空间要求： 操作平台尺寸（长×宽×高）：82.5×39.8×81.7cm 重量：23.58Kg （此外，还需要有放置配套电脑的空间及载重） 温度要求：15-30℃ 相对湿度：15％～80％，无冷凝 电源：100-240VAC 其它：通用插头接线板 培训所需试剂设备及样品 设备耗材： 1) 台式离心机 震荡混旋器 移液器(10、20、200(l规格) Eppendorf管，Tip头（带滤膜），乳胶手套等 PCR反应管 灭菌双蒸水 以上物品请您提前准备妥当，基因公司培训人员将使用以上物品进行StepOne定量PCR仪的使用培训工作。 使用试剂：上海晶泰生产“乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒”（基因公司提供） 四、培训程序及时间安排 （请至少安排2名实验室长期工作人员参加培训，以熟悉仪器操作并能负责仪器使用） 培训时间安排(1天)： 荧光定量PCR技术原理及应用讲座； StepOne系统技术特点讲解、仪器系统组成和工作原理讲解； 仪器安装及使用培训； 定量PCR演示实验； 软件基本功能综述及使用培训 五、实验操作流程 一）、实验目的：验证机器的重复性、光路的均一性及了解机器和软件的使用及其特点。 二）、实验内容：标准曲线验证及重现性检测（三个完全相同的扩增体系实验）实验。 使用试剂：用上海晶泰生产“乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒”（基因公司提供） 三）、仪器及耗材：移液器(10、20、200(l规格)，0.1ml PCR光学反应管8个，eppendorf离心管（0.5ml）4个。 四）、实验方法（探针法）: 试剂准备： 反应管数 1 N* 混合液的准备 HBV PCR Mix HotStar Taq 15 μl 0.2 μl 15 μl*(N+1) 0.2 μl*(N+1) 总的体积 μl 91.2 注：N为标准品数，1为阴性对照 试剂使用前都混匀并低速离心。 加样：将定量校准品（使用前先离心，再充分振荡混匀）各5μl分别加入反应管中，每个浓度设置三个重复，同时设置一管NTC（no template c