拟南芥阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的原核表达、纯化及酶催化特性.PDF

1060 生 物 工 程 学 报 屈亚平 等/拟南芥阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的原核表达、纯化及酶催化特性 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn August 25, 2016, 32(8): 1060−1069 DOI: 10.13345/j.cjb.150479 ©2016 Chin J Biotech, All rights reserved 工业生物技术 -5- 屈亚平，张智俊，王超莉，王蕾，吴林军 311300 , , , . -5- . , 2016, 32(8): 1060–1069. Qu YP, Zhang ZJ, Wang CL, et al. Expression, purification and characterization of arabinose-5-phosphate isomerase from Arabidopsis thaliana . Chin J Biotech, 2016, 32(8): 1060–1069. 摘 要: 阿拉伯糖-5-磷酸异构酶 (KdsD) 是 2- 酮-3-脱氧辛糖酸 (KDO) 生物合成途径的第一个关键限速酶， 通过无缝克隆技术将拟南芥KdsD 基因构建至原核表达载体pET-HTT ，经过IPTG 诱导，在大肠杆菌BL21 (DE3) 中获得了大量重组蛋白的可溶性表达；表达产物经Ni-NTA 亲和层析和分子筛层析 (SEC) 方法进行酶蛋白的 分离纯化步骤，得到纯度85%以上的高纯度酶；分子筛层析结果发现纯化后的目的蛋白KdsD 在溶液中主要以 多聚体、二聚体和单体形式存在，这同微生物来源KdsD 酶在溶液中以四聚体形式存在很大差异；进一步使用 Western blotting 和MALDI-TOF MASS 技术对纯化的蛋白进行鉴定；测定了拟南芥KdsD 酶学性质，证明该酶 催化反应的最适pH 值为 8.0 ，最适作用温度为37 ℃，各种金属离子在低浓度均对酶活性存在不同程度的抑制 作用，其中以Co2+ 、Cd2+对酶活性的抑制作用最强，而5 mmol/L 金属螯合剂EDTA 对酶有激活作用。此外，以阿 拉伯糖-5-磷酸 (A5P) 为底物时，拟南芥KdsD 酶动力学常数V 和K 值分别为0.18 mmol/(L·min) 、0.16 mmol/L ， max m 比较发现该酶与底物的亲和性高于大肠杆菌KdsD 。以上研究结果为KdsD 蛋白结构与功能及其在新型抗生素 研制领域中的工业化应用奠定了基础。 : 拟南芥，阿拉伯糖-5-磷酸异构酶，重组表达，分离纯化，MALDI-TOF MASS ，酶学性质 Received: November 13, 2015; Accepted: December 30, 2015 Supported by: Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. Y14C160039). Corresponding author: Zhijun Zhang. Tel: +86-571 E-mail: 397942805@ (No. Y14C160039) 2016-01-15 /kcms/detail/11.1998.Q1716.001.html