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RNA 的提取 TaKaRa Code：D9108A 1. RNAiso Plus的使用量情况如下。 2. 实验样品的研磨和匀浆。 A. 贴壁培养细胞 ① 倒出培养液，用1×PBS清洗一次。 ② 每10 cm2生长的培养细胞中加入1 ml的RNAiso Plus，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于 细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥 离细胞）。 ③ 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④ 室温静置5分钟。 B. 悬浮培养细胞 ① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。 ② 向每107个细胞中加入l～2 ml的RNAiso Plus。 ③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④ 室温静置5分钟。 C. 动物组织、植物材料样品 ① 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。 ② 对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Plus的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。 ③ 将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。 ④ 12,000 g 4℃离心5分钟。 ⑤ 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 3. Total RNA的提取。 ① 向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5分钟。 ② 12,000 g 4℃离心15分钟。 ③ 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 ④ 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。 ⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 4. RNA沉淀的清洗。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。 5. RNA的溶解。 室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。 简易流程 有关RNA的吸光度说明如下： 260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD28O（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.2之间，当R1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。 在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer。 RNA浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04 μg/μl RNA质量验证 一般的，RNA 的电泳都是用变性胶进行的，但是，如果你仅仅是为了检测RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。 我们用的是1.5%的琼脂糖凝胶电泳，如果提取出的总RNA如果完整性好，没有降解，电泳后应能清晰的看到28s和18s两条带，并且28S是18S的两倍。两条带若不明显呈弥散状态，则说明RNA已经部分降解，可能是污染了ＲＮａｓｅ或操作剧烈。使用非变性电泳检测 RNA，当用 1.0 - 1.2% 的进口品牌 Agarose 电泳，以 DNA Marker 做对照，28S 和 18S 条带分别在 2kb 和 0.9kb 左右 ．材料与方法1 材料RNA样品2 仪器、用具电泳仪 、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、移液器 等3 试剂(1) 1×TBE 电泳缓冲液(2) 溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心操作](3) 琼脂糖(4) 6×加样缓冲液4 方法(1) 选择孔径大