RT-PCR 原理.docxVIP

RT-PCR原理与实验操作■ 提取RNA(我做细胞的)1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzol（量大无防！）,细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管中.2.颠倒摇晃10下，室温5分钟.3.在2个EP管中各加入0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。4.在2—8°C下用不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。5.用移液枪分别转上层水相（约500-600μl）于另二个1.5mlEP管中,加等体积异丙醇（约500-600μl），混匀室温10分钟来沉淀RNA→在2—8°C下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。6.舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4°C或-20°C) 1 ml来洗涤RNA沉淀→在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。;离心前注意放管的方向,注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年!7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用20-50μl DEPC水溶解。(建议装于0.6的EP管中.)8紫外光度检测注:该步后,可保存于-70℃超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录.■ RT反应体系注意事项1.RT试剂盒中试剂解冻后,摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作.2 PCR仪预热到50°C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录.3反应体系准备:比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物,在分装于PCR管中(分装前宜离心!),再分别加 RNA和引物/内参;4 RNA的量宜大2ug/reaction!5 要有要有逆转录(50℃,30min)和初始热活化(95℃, 15 min);■Reaction componentsfor one-step RT-PCR using Q-Solution（我的一步法）ComponentVolume/reactionFinal concentrationMaster mixRNase-free water (provided)–5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer* 10.0/5 μl1xdNTP Mix (containing 10 mM each dNTP)2.0/1 μl400 μM of each dNTP5x Q-Solution 10.0/5 μl1xPrimer A 0.6 μM?Primer B0.6 μM?QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mixx 2.0 /1μl –Template RNA0.5/1 pg – 1/2 μg/reactionTotal volume 50.0/25ul_注:引物/内参在反应体系中的浓度为20μM.反应体系要搞清!■PCR反应体系steptimetemperatureReverse transcription30min50℃Initial PCR activation step15 min95℃3-step cyclingDenaturationAnnealingExtensionNumber of cyclesFinal extensionGAPDH：(+)5-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3；//(-)5-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3扩增片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94℃ 3 min，94℃ 40 s、59度40 s、72度1 min 7个循环，94℃ 40 s、56度40 s、72度1 min 25个循环，72℃延伸5 min。bcl-2+)5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3//(-)5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3扩增片段长度为319bp。bcl-2扩增条件为94℃4min，94℃ 30s、63℃ 30s、72 ℃ 1min,33个循环,72℃ 7min；bax扩增条件为94℃5 min, 94℃ 30s、63℃ 30s、72 ℃ 1min,94℃ 1 min，31个循环, 72℃7min。■电泳1 电泳缓冲液: 0.5×TBE:工作缓冲液0.5×TBE,我的是10×TBE的浓缩液, 100ml 的10×TBE的浓缩液加入1900的三蒸水,既