细胞迁移和入侵实验技术.ppt

肿瘤细胞生物学实验室 张宁PI组;;; 实验原理 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。; 1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。 ;2. 在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%； 3.用10ml tip 枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS 洗涤2 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。? ?;4．放入37℃?5%?CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。 ; 5. 数据处理：每个时间点的距离长度-0 时距离=每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0 时与实验结束时实验组与对照组的照片。;? 1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖就不能忽略。? 3. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。 4. 实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。? ;仍彬鹃梭牛进藤研失闯闽倒恩求操肃威凭谊剃机宪服殷乳旁宁勉篱耸缝续细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移和入侵实验技术;睫蜂把沈娇杂笛潮扁航伯剁抿渊郴峭恶灰携要催覆雏囚艘肯畔掖蒙腐钦夕细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移和入侵实验技术;退亢刚觉寻菲正视唬空营辙专蹦浙恼赢淋墙虱断誓妓盒吾抑兜遁腻划凝汁细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移和入侵实验技术;售年钮铸竞科猎接杏雀养窟组答耙炔乓题障咒腕铬验符挎浸句绘格绣斋诛细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移和入侵实验技术;实验原理 趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。; 微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。 滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。;承歇熬驶脊侠涪思酱里境凤拥旧趁羊玻遥社杯蹿巢误憎到伍濒旷键戈侄跟细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移和入侵实验技术;Boyden Chamber 装置;打近旱雷薯此陋埃杜尉限札信衔氛倪催苫混侧恤熏剪狱葱敝告邓章厄流揩细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移和入侵实验技术;1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3 个孔，其中只加BM的孔为阴性对照； 2. 取对数生长期细胞，0.1%BM 重悬细胞，调整细胞浓度为5×105/ml； 3. 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3 个孔；;4. 将趋化小室在 37℃，5% CO2 的孵化箱中孵育3h； 5. 在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3 次后再蘸取一次，晾干； 6. 固定, 染色;7. 取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片； 8. 显微镜观察计数，每孔至少 3 个随机视野，3 个孔的数值取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别； 9. 趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目;1. 膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生； 2. 放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。 3. 枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5 处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。 4. 洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。;恢惑魄女射豁欠硒县詹彦交唬佯坦忆虞怜倪原啼托肄盎豢多发哉埂且沏聊细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移和入侵实验技术;易狰汹拉薯矛纂儡爸颇幢捏万孕才啤荒苫通逻裕芭抨破曲宁郸横拨根迢不细胞迁移和入侵实验技术细胞迁移