分子生物学技术04168.ppt

分子生物学实验技术 几种常用PCR技术 1）、差异显示PCR 2）、内参照相对定量PCR 3）、实时PCR用于基因拷贝数分析 均可用作对基因拷贝数的分析，即对DNA，RNA进行定量分析 1、转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞，胚胎干细胞中（或其它受体细胞），通过外源基因与受体细胞染色体DNA之间随机重组的发生而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA分子上的过程。 2、 利用转基因技术可以制备转基因动物（植物）或转基因细胞。并被转入外源基因的动物或细胞能将将外源基因遗传给后代。 反义RNA调控 1984年Adelman等发现大鼠的促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone,GnRH）的基因两条链都能转录，首次在真核中发现了反义RNA。 在线虫（C.elegans）中，控制幼虫发育的基因lin 14基因受到lin 4基因的反义调节。这是一种对翻译模板的抑制来进行调控的途经。 图二：不同哺乳动物细胞对siRNA诱导的基因沉默的易感性。 如图所示的细胞株分别用化学合成和体外转录制备的siRNA转染。48小时后收获细胞，分离纯化RNA，变性胶电泳，Northern分析GAPDH探针和 cyclophilin, 和28S rRNA对照。 报告基因： 这种基因所产生的蛋白或某种信号很容易被检测，这个蛋白或信号能用作显示它的定位或者基因的表达水平。(特别用于研究基因的表达水平，检测启动子的活性或翻译活性等） 常用作报告基因的有，氯霉素乙酰转移酶，半乳糖苷酶，荧光素酶Repoter gene A gene attached to promoter, or tanslation start site, and used measure the activity of the resulting transcription or translation. The reporter gene serves as an easily assayed surrogate for the gene it replaces. 该基因的产物或产生的信号容易被分析和检测，把该基因连到某一基因的启动子或翻译起始部位代替原基因用以测定该启动区的转录或mRNA的翻译活性。 本章复习题（分子技术） 1、末端终止法测DNA序列实验共分个管，每管除含常规的引物，底物，酶等外还各加入一种核苷酸，待测DNA模板可被制成的寡核苷酸片段，而凝胶电泳可分辨的寡核苷酸片段，最终的电泳图谱呈条带排列。 2、在进行内对照相对定量PCR时，常用的内参基因是和，它们都是。 3、转基因技术是将外源目的基因导入或细胞内，然后将已转入外源基因的该细胞导入—动物子宫使发育成个体。 3、动物克隆技术是将动物的一个—导入另一个激活的—--内，然后将该细胞植入—内，使发育成个体。 4、基因敲除技术所应用的基本原理是，但和技术也能使，达到相当于基因敲除的作用（基因敲减）。 5、在传统的基因敲除技术中所用的基因打靶载体包括，和；其中是— 筛选标志，是—筛选标志。 二、名词解释： 实时定量PCR，CyCle Threslold ，CT值， 条件性基因敲出 三、问答题： 1、在制作基因敲除小鼠时所用打靶载体通常包括哪些组分？筛选已发生同源重组的胚胎干细胞的原理是什么？ 2、简述转基因，基因敲除和核转移技术在概念上的基本区别。 3、简述末端终止法测DNA序列的基本原理 4、简述用实时定量PCR测定基因拷贝数的原理 5、何谓实时定量PCR，画出用该方法测定未知DNA模板数的标准曲线 * （二）、基因敲除的原理与程序 关于同源重组：homologous recombination Holliday intermadiate 内切酶 (recBCD) DNA侵扰 (recA) 分支迁移 (recA) 内切酶 (recBCD) DNA 连接酶 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ Holiday中间体 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 目 录 Holiday中间体 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′