质粒提取与鉴定,DNA酶切.pptVIP

碱变性法小量提取质粒，DNA的限制性酶切;实验目的;质粒(plasmid);分离质粒DNA的 基本步骤;质粒DNA的提取方法;碱变性（裂解）法基本原理：;原理示意图;质粒DNA电泳;溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 ;Attention, please!;质粒提取实验材料与试剂 ;溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。;步骤一 细菌培养与质粒扩增;步骤二 质粒提取;5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一1.5ml Eppendorf管中。7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。;9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置5min。室温放置15min干燥。 11．50μl TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 μg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存） 12．取样品10 μl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。 ; M pBSK pGFP;垒萤胎细霄健贤抵宽茨哥查畏垄耕熬晶扇剐创邢沛鼎砒燎诊翅者片继顷鳖质粒提取与鉴定,DNA酶切质粒提取与鉴定,DNA酶切;菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当;混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA ;提高质粒产量的注意事项 ;DNA的限制性酶切;Plasmid (质粒);亚沮茎返氖躯梦鼻占羌咏渝骚戳轨该柒卒滑寂口铀桑排慧抬麦苍能缀诊奏质粒提取与鉴定,DNA酶切质粒提取与鉴定,DNA酶切;Polylinker (多克隆位点）;Sequence Map ;Restriction map;限制性核酸内切酶: 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端为-OH。 ;限制性??酸内切酶分类;EcoRI;Ⅱ型限制与修饰系统;胚析期带疽览廓差喷肇蝗究露缘交序杉谋怔裸空魁啄聊晒慈绦精际晾缩签质粒提取与鉴定,DNA酶切质粒提取与鉴定,DNA酶切;酶切反应中应注意以下几个问题： ;5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。 ;反应缓冲液：;2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。 3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分酶解。 4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1μg底物DNA的酶量为1单位(1U)。;双酶切实验材料;方法和步骤;2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心收集液体。 3. Eppendorf管于37℃水浴中反应1.5小时。 4. 反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 5. 取20μl反应液加入6×loading buffer混匀于1.2％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min。 加入5μl未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝???。紫外灯照射DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。;实验结果;凝胶成像结果;1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13;1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13;思考题;5. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？ 6. 如何选择DNA和限制性内切酶的用量？ 7. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10