植物组织培养实验-种子实验.docVIP

植物组织培养实验 一、实验目的： 通过学习培养基的配制，材料的消毒接种和培养等操作，掌握植物种苗快速繁殖和种苗脱毒技术繁 。 二、实验内容: 1、母液的配制与保存 2、固体培养基的配制与灭菌 3、石斛等实验材料的接种和培养 三、实验设备和实验药品: 1.药品:MS培养基药品 2.生长调节剂,6-BA,NAA等 3.玻璃仪器:烧杯,量筒,容量瓶,吸管等 4.设备:高压锅,超净工作台,培养箱等 四、实验步骤： A培养基贮备液（母液）的配制 (一)MS培养基的组成 1、大量成分→贮备液I mg/L NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 2H2O 440 MgSO4 7H2O 370 KH2PO4 170 配制20倍浓度贮备液500mL. 2、微量成分→贮备液II mg/L KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4 4H2O 22.3 ZnSO4 7H2O 8.6 Na2MoO4 2H2O 0.25 CuSO4 5H2O 0.025 CoCl2 6H2O 0.025 3、铁→贮备液III mg/L FeSO4 7H2O 27.8 Na2 EDTA 2H2O 37.3 4、有机成分→贮备液IV mg/L 肌醇 100 烟酸 0.5 盐酸硫胺素(VB1) 0.1 盐酸吡哆醇 0.5 甘氨酸 2 (二)常用生长调节剂 6-BA：1mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。 NAA:1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。 1N HCL，取8.4毫升的盐酸加水定容100毫升 1N NaOH，取氢氧化钠4克,加水100毫升 B 固体培养基的配制与灭菌 称量 混合 调pH值 灭菌 C外植体材料的预处理、消毒及接种 （一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。 （二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一步减少污染的处理。 同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。 （三） 将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30 min后关掉紫外灯。 （四）?操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。 （五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100 mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。 （六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。 （七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。 逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭