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血细胞分离培养 以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等血细胞都属终末分化细胞 , 很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代 , 近年来由于细胞培养技术的发展 , 已有血细胞培养成功的报道 , 正常血细胞在体外培养生长时间短 , 只有白血病细胞 , 血友病细胞、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系 , 但多半为 EB 病毒等致瘤病毒引起的转化细胞 , （ EBNA 检查阳性） , 二甲基亚砜（ DMSO ）处理也可诱导这些细胞分化发生逆转 , 表现为正常细胞 . 所建立的细胞系多半为单核细胞系、 B 淋巴细胞系、 T 淋巴细胞系 , 只在 IL-2 产品问世后 ,T 细胞才可在体外建系、建株 . 血细胞可从外周血中用梯度液通过离心分层后分离获得 . 也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞 , 从腹腔刺激后的冲洗液中可获得大量的单核 - 巨噬细胞 , 从骨髓中可以获得前提血细胞 , 并可长期培养生长 . 加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖 , 例如在淋巴细胞中加入 IL-2 （ TCGF ） , 可促进 T 细胞生长 , 建立 T 淋巴细胞系 . 在多发性骨髓瘤细胞（ B 细胞）培养中 , 加 B 细胞生长因子 , 可建立 B 细胞系；加入 IL-6 （或正常淋巴细胞培养 48h 的培养上清中的 IL6 ）可使 B 细胞在体外长期培养 , 建立了 IL-6 依赖的 B9 细胞系 . 在骨髓单个核细胞培养中加入二羟基维生素 D3, 可使单个核细胞分化为成骨细胞及破骨细胞 . （一）外周血细胞分离： 外周血中除红细胞外 , 还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等 , 通常是分离这些血细胞的重要来源 . 其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、 Ficoll 分离法 . 1 、自然沉降法： 将无菌抗凝血放入试管中 , 在 37 ℃ 水浴中静置 , 自然沉降 1-2h, 可见到红细胞下沉 , 并有明显分层 , 上层血浆中富含有大量的 和淋巴细胞 , 下层主要为红细胞 . 此方法简便但各层中的细胞种类多 , 不纯 . 血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主 , 但也含有血小板 , 大单核细胞和少量红细胞 . 下层虽以红细胞为主 , 但也有上述各种细胞 , 此法适用于淋巴细胞转化试验 . 2 、差异沉降法： 用 6% 的右旋糖酐或 3% 的明胶溶液无菌消毒后 , 分装于中试管中 , 由于这些物质能使红细胞形成 “ 串状 ” , 比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快 , 因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开 . 其方法如下：用 6% 的右旋糖酐溶液 5-10ml, 经抗凝血 5ml 加入上层中混合后静置于 37 ℃ 水浴中 30-60min, 即可见红细胞下沉 , 上层富含大量粒细胞和淋巴细胞 , 下层为红细胞 , 使两者易于分离开 , 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验 , 下层可用于红细胞培养和实验 , 经 PBS 洗 3 次后即可加入培养基培养 , 可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产 . 此法分离的细胞纯度也不高 . 3 、氯化铵分离法： 0.83% 氯化铵（ NH4CL ）可使红细胞破裂 , 通常将分离获得的粒细胞 . 淋巴细胞中混有的少量的红细胞用 0.83% 氯化铵进行裂解 , 以排除红细胞的干扰 . 另外 , 此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备 , 在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用 . 方法如下： 将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经 2000r/min 离心 20min, 吸出上清血浆 , 将下层的红细胞、白细胞混合后 , 加入 0.83 氯化铵 , 用量为血细胞悬液液量的 3 倍 , 于 4 ℃ 作用 20min 后离心弃去上清 . 在沉淀层中再加入新鲜 0.83 氯化铵混匀后于 4 ℃ 作用 20min, 以便彻底清除红细胞 , 离心弃上清 . 收货下层的细胞用 PBS 洗 3 次后 , 再用含 5% 人 AB 型血清的（含 100U/ml 卡拉霉素）培养基制成悬液 , 调整细胞浓度为（ 8-10 ） x10^9 个 /L, 分瓶加塞在 37 ℃ 普通培养箱中旋转培养（ 12r/h ） . 混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（ NDV-F ）诱导 22h, 收货上清就可生产白细胞干扰素 . 此法分离的细胞纯度更差 . 4 、 Ficoll 分离法： 采用 Ficoll 和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液 , 通过 2000r/min 离心后可使血细胞以不同相对密度分离开 , 如分离淋巴细胞可选用相对密度 1.077 的分离液；若分离血小板可