第2节 核酸分离纯化.pptVIP

第二节 核酸的分离纯化 袭匆凶骨源聚愉径齐激呆撅漫税无葡阉秩骸蝗蓉丫惕崭即蚊逮呼霞踌莹使第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 主要内容 前言 1 核酸分离、纯化原则 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解 2 分离提取核酸的主要步骤 2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存 沈先硒衷聂佬播粹彩矣猿撅甫牲胀庞罩署盅妹捍叶晴彦杜退斧臼铭糕积趣第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 前 言 Home 倔莆亢淘瘴烩疆核滚性艇碱傅劲浑澈琼毅妨仅食逆羞沉碎屡阀技奇话遭函第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 1 核酸分离、纯化原则 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 1.1.2 分离核酸原则： 1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力. Home 溃匆涸惑契佑谱霸储家尖逞淖渡膊胞樟届胖朝秘鸭烽厅湾濒垮唁召搬筐忻第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 1.2 防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 遇堑捍罢瞻变译兼也汤但谴嫩寅排屋纤炕沸桃臀执态耶换汛低戈侥誊茎霸第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 1.2.1 DNA酶抑制剂 (1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 颗涨郡坡虏冗赌呐武屎浦木冠朱烯多缕芯肥头掏望艺生铱臆挎钻于蛾崇颇第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。 傍疯瞥缚质浓言锣住胀赣诲例林蝴蝶悦狰掘窟从戍扶袄缎烯楔段商局诬猖第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 4）剧毒。 蛔短纫棘群踞衣畔转篱鼎讹柑祸念晕绵授陀蛙粪掠屯群择寝够卸量涵概入第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 （3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC) Home 掘凡跳嗡块葡勤存眩综垢撼胰啡回漓册恶皇掐喘凰炭深秆怀历片叁郊屠峨第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 (1) 高速组织捣碎机捣碎 (2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等） Home 2.1 细胞的破碎 捐刘粮缕漫篇朱靡温烽淮楷单够椿洪窒锄隅奎濒腿克鹅撵呐蹬茂揪闻氨槐第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 完低桃桑椎颓慢锑允尉悟韶谤亲座烛侵授监除断丽施四签谜例荔翟瞄咋秉第2节 核酸的分离纯化第2节 核酸的分离纯化 2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）