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实验二 过氧化氢酶Km值的测定 课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2006 专业、层次：临床医学本科 　　　　 授课教师：许成山 职称：讲师 　　　　 学时：3学时 基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》 教学目的与要求： 1、巩固酶促反应有关参数的知识，加深理解Km值的定义； 2、学习Hanes作图法测定Km值的原理和方法； 3、掌握滴定管的使用和滴定终点的判断。 大体内容与时间安排： 1、Km值的定义及求Km值的作图方法（林-贝氏作图法和Hanes作图法） 5min 2、过氧化氢酶Km值测定的原理 5min 3、过氧化氢酶Km值测定的注意事项 10min 4、学生做实验 100min 教学方法：讲授式+启发式 教学重点、难点： 重点：1、Hanes作图法求Km值 2、过氧化氢酶Km值测定的原理 3、滴定管的使用和滴定终点的判断 难点：过氧化氢酶Km值测定的原理 一、Km值的定义： （一）当酶促反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度即为Km值。 （二）Km值是酶促反应的特征性常数。 二、实验原理 （一）双倒数作图法（林－贝氏作图法） 以1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标求Km值。 （二）Hanes作图法 [S]/V为横坐标，以[S]为纵坐标求Km值。 （三）过氧化氢酶Km值测定的原理 1、H2O2在过氧化氢酶的作用下分解生成了H2O和O2； 2H2O22H2O+O2↑ 2、[S]=加入的H2O2的量； 3、V=固定时间内反应掉的H2O2的量=加入H2O2的量－剩余H2O2的量； 4、剩余H2O2的量可通过KMnO4滴定测出： 2KMnO4+5H2O2+3H2SO4→2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O 三、实验操作 l、血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。 2、H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。 3、反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。 加入物(ml) 1 2 3 4 5 H2O2(约0.08mol/L) 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 蒸馏水 3.0 2.50 2.00 1.50 1.00 室温摇匀，依次加入1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。 四、计算 1、 （式中：4为反应液量4ml） 2、反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。 反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的H2O2 mmol数 即：H2O2 mol浓度×加入的毫升数－KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2 （式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数） 3、求Km值： 下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。 己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下： 计算程序 1 2 3 4 5 ①加人H2O2数 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 ②加人H2O2mmol=①×0.08 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 ③底物浓度［S］=②÷4 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 ④酶作用后，KMnO4滴定ml 1.35 3.70 6.40 9.80 13.20 ⑤剩余H2O2mmol=④×0.004×5/2 0.0135 0.037 0.064 0.098 0.132 ⑥反应速度V=②一⑤ 0.0265 0.043 0.056 0.062 0.068 ⑦[S]/V=③÷⑥ 0.377 0.465 0.536 0.645 0.735 按前述方法作图求得Km＝0.032mol/L。 五、注意事项 1、加入1:1000稀释血清0.5ml/瓶后保温准5分钟；