超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定同工酶电泳.docxVIP

实验二猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳一、实验原理超氧化物岐化酶SOD广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。根据金属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD硬进行纯化。酶活力测定可用以下方法：黄嘌呤氧化酶法、细胞色素C法、肾上腺素自氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚自氧化法等。而该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。SOD同工酶奠定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法显示。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处显示为蓝色，又SOD处为无色透明，由此可以鉴定SOD同工酶酶谱。实验试剂与器材ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。操作步骤SOD提取取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为0.15：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心10min，收集红血球。然后用2倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4 000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液0.5mL。过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度），上清液加热到65℃-70℃，保温15min，然后迅速冷却到室温，4 000r/min离心5min，弃去沉淀物，收集上清液（样品2记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。粗酶液中加入等量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，冰箱中静置1h，然后4000r/min离心10min，弃去滤液得沉淀。讲沉淀用丙酮洗两次，离心收集沉淀，自然干燥得绿色成品，称重。按1mg/1mL溶于蒸馏水，备用。2、SOD酶活性测定（1）邻苯三酚自氧化速率的测定。取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07。（2）酶活力测定样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。（3）酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按照下列公式计算酶活性：单位活性(u/ml)=(Ao-Am)/Ao×100% ×反应液总体积数×样液稀释倍数样液稀释倍数50%样液体积其中Ao为邻苯三酚自氧化率；Am为加酶后的邻苯三酚自氧化率总活性（U）=单位活性×酶原液总体积（4）蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝G-250法）a标准曲线制作：6支试管试剂试管123456蛋白标准液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝（ml）555555蛋白质含量（ug）020406080100盖上塞子，摇匀。在595nm下闭塞测定光密度值，1h内完成。以牛血清蛋白（ug）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。b样品中蛋白质含量测定讲待测的SOD溶解病稀释到一定浓度，取一直具塞试管，移液抢加入0.1mL样品提取液，加入0.9mL蒸馏水和考马斯亮蓝试剂，其余操作同上。c蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查的相应的蛋白质含量，计算其浓度。（5）结果处理 利用考马斯亮蓝法测定没毫升酶原液蛋白质毫克数。将测得的数据或计算结果填入