生物抗氧化成分的测定.doc

生物抗氧化成分的测定 SOD(超氧化物歧化酶）活力和含量的测定 SOD活力的测定（邻苯三酚氧化法） 1.原理 利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入SOD酶液则抑制其氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光量。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。 仪器及试剂 UV-260自动紫外光分光光度计（或其他型号）。 pH8.2、50mmol/L Tris - HCl缓冲液 50mL 50mmol/L Tris加20mL 50mmol/L HCl，用水稀释至100mL，调pH至8.20。 50mmol/L KH2PO4-NaOH缓冲液 5mL0.2mol/L KH2PO4-NaOH加4.5mL0.2mol/L NaOH，用水稀释至20mL，调pH至7.8。 50mmol/L邻苯三酚溶液 用10mmol/L HCl配制。 测定步骤 样品液制备：称取5.0g鲜样，加10mL50mmol/L pH7.8磷酸盐缓冲液，匀浆，过滤，滤液置透析袋内，于5~7℃冰箱内动态透析6~8h（亦可每小时换透析液一次，透析液为pH7.8磷酸盐缓冲液）。若样品为溶液，可直接加pH7.8磷酸盐缓冲液透析。 邻苯三酚自氧化速率的测定：在室温下（20~22℃），取5mL 50mmol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液，加5μL 50mmol/L邻苯三酚，摇匀，在325nm下，1cm比色皿，以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白，立即测定吸光度，并每隔0.5min测定一次，自氧化速率控制在每分钟0.060~0.065（一般测定4min，求得每分钟平均变化率）。 样品中SOD测定：取5mL 50mmol/L pH8.2 pH8.2 Tris-HCl缓冲液，加待测样品透析液5~20μL ，加5μL 50mmol/L邻苯三酚，摇匀，立即同上测定。 计算 式中 V0——自氧化速率吸光度； V1——样液速率吸光度； n——稀释倍数； V——反应液总体积（mL）； V——样液总体积（mL）； SOD活力的测定（化学发光法） 原理 黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤氧化生成尿酸的同时产生O·，O·与化学发光剂鲁米诺（氨基苯二酰肼）反应生成激发态的中间物，当中间物返回基态时，以光辐射的能量产生发光现象，由于SOD能清除O·,所以抑制鲁米诺的化学发光，其抑制程度与酶活力大小有关。 2. 仪器及试剂 （1）生物化学发光仪。 （2）0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（含0.1mmol/L EDTA-Na2，pH10.2）称取Na2CO3 3.68g，NaHCO3 1.28g，EDTA-Na2 37.22mg，用水溶解并稀释至1000mL，4℃储存1~2月。 （3）0.05mol/L磷酸盐缓冲液（含0.1mmol/L EDTA-Na2，pH7.8）称取K2HPO4 7.970g，KH2PO4 0.579g，EDTA-Na2 37.22mg，用水溶解并稀释至1000mL，室温放置1周。 （4）0.1mmol/L 黄嘌呤（Xanthine） 黄嘌呤3.8mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液至250mL，新鲜配制。 （5）0.1mmol/L 鲁米诺（Luminol） 鲁米诺4.45mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液至250mL，新鲜配制黄嘌呤-鲁米诺混合液（1+1），用前新鲜配制。 黄嘌呤氧化酶（0.1mg/mL） 黄嘌呤氧化酶（46mg/mL）22μL加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液10mL，用前新鲜配制（黄嘌呤氧化酶也可根据酶活性大小配成适当浓度，以在发光仪空白300~400mV的读数为宜）。 超氧化物歧化酶标准品。 测定步骤 SOD标准曲线的绘制：将标准品SOD用0.05mol/L磷酸盐缓冲液稀释成2，4，6，8，10ng/mL，取不同浓度SOD液10μL，加黄嘌呤氧化酶10μL，再加鲁米诺-黄嘌呤混合液980μL，测定反应1min后6s的发光值（mV），空白对照用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）10μL代替，以空白对照的发光强度为100%，抑制发光程度为纵坐标，SOD浓度为横坐标，绘制标准曲线，求出抑制50%发光程度时SOD的浓度C50（mg/mL）。 样品测定：取血样10μL，加入到0.5mL水中，充分振摇使之溶血（1+50）。试剂添加量如表2-8-1所示。 表2-8-1 样品测定时试剂添加量 试剂/μL 样品管 空白管 样品管 空白管 溶血液量 0.05mol/L磷酸盐缓冲液量 10