猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定.docxVIP

实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学刘志坚 、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。Mn—SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。其中，Mn—SOD 、Fe—SOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，Mn—SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，Fe—SOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。它的功能为：抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。具有调节血脂的保健作用，可预防动脉粥样硬化，预防高血脂引起的心脑血管疾病。降低脂质过氧化物的含量。抗衰老：年龄的增长和某些体外因素会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常清除自由基的能力，从而使皮肤组织造成伤害，导致衰老。由于SOD能够清除自由基，因而可以延缓衰老。防治自身免疫性疾病：SOD对各类自身免疫性疾病都有一定的疗效。如红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎等。肺气肿：肺气肿患者亦可使用 SOD ，但应在病变初期肺弹性纤维尚未受到损害时使用，疗效较好。辐射病及辐射防护：对有可能受到电离辐射的人员，可注射 SOD 作为预防措施。老年性白内障：对这类疾病应在进入老年期前即开始经常服用抗氧化剂，或者说经常注射SOD。一旦形成白内障，则应该摘除，因为此时使用SOD无效。抗氧化：医学报告指出，抗氧化能力的衰退期已提前至40岁左右，光靠蔬果已经不足以消除人体内外共同形成的氧化压力。预防慢性病：自由基是科学家最近才发现导致各种慢性病与老化的罪魁祸首，故说它是“万病之源”，是人体健康的大敌，自由基对身体的伤害是日积月累的，尤其是糖尿病与心血管方面的疾病。抗疲劳：过多的自由基在体内残存，就犹如毒素蓄积在体内一样，会让人：容易疲劳、厌倦、注意力不集中、常常昏昏沉沉、打哈欠。SOD对上班族熬夜加班、学生应付考试所产生的疲劳，在提振精神及集中注意力方面成效显著，有助于工作绩效的提升，及考试成绩的进步。二、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老。抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛的应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、 pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内的含量的相对平衡。机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。本实验采用有机容易沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测