转基因大豆玉米水稻深加工产品的五重巢式pcr技术检测.doc

转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测 ??????? IP(Identity Preservation)管理，加强检测监控。 深加工品经过若干道加工程序，理化性质变化、 DNA断裂，转基因成分检测的难度大大增加。目前，国际上没有统一的针对转基因粮食作物深加工产品的检测标准，而我国也没有建立有效的检测标准对市场上常见的转基因大豆、玉米和水稻深加工产品中的主要外源CrylA (B)、BAR、CP4 EPSPS和PAT基因进行检测。 五重巢式PCR是近几年出现的检测技术，它结合了巢式PCR的高灵敏度和多重PCR的快速、简单和高特异性特点，可以减少假阳性，可以同时检测多个基因片段，可以使检测灵敏度的下限提高几千倍‘3]。五重巢式PCR方法快速、灵敏度高，在人和动物疾病检测和病毒鉴定中应用较多。目前该技术在转基因检测中的应用还较少，仅在转基因大豆深加工制品和转基因水稻种子的检测中有半巢式 PCR应用的报道。但这些技术仅能对转基因大豆或水稻单一品种进行检测，在做不同品种或品系转基因成分检测时，需要分别试验，比较繁琐。迄今为止，还没有快速、高通量同时检测不同品种和不同品系的转基因大豆、玉米和水稻外源基因的报道。本研究旨在建立五重巢式PCR体系，探索粮食深加工产品中的转基因成分，实现不同品种和不同品系粮食作物转基因成分的高通量检测，为转基因深加工产品检测标准的建立提供理论基础。 1? 材料与方法 1.1材料 1.1.1? 试验材料 转基因RR大豆购自美国孟山都公司；转基因玉米Bt11、Bt176由吉林农科院惠赠；转基因水稻由农业部转基因生物安全管理办公室提供；转基因玉米MON810、TC1507、T25和CBH-351购自香港基因芯片公司，作为阳性对照。非转基因大豆、玉米和水稻由东北农业大学农学院提供，作为阴性对照。待检深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片（含有稻米成分）和玉米泥均购自超市，均未注明是否含有转基因成分。 1.1.2试验试剂 Wizard@试剂盒，Promega公司(Madison， USA)；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液（含MgC12）、DL DNA2000分子质量标准，大连宝生物工程有限公司；特异引物，上海英俊生物公司。 1.1.3仪器设备 高速离心机（上海安亭公司，TDL-40B型）、 PCR仪（德国Biometra，Biometra Tgradient型）、核酸电泳仪（杭州托普仪器有限公司，GE-100型）、紫外分光光度仪（美国BECKMAN，DU@ 640型）、凝胶成像系统（美国UVP，G8000型）。 1.2方法 1.2.1? DNA提取 将转基因大豆、玉米、水稻和非转基因转基因大豆、玉米、水稻分别按不同质量比混合成标准品，取标准品和待测样品（按操作说明要求的质量）分别根据Wizard@试剂盒操作说明进行DNA提取，并用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(50 ng/uL)。 1.2.2? 引物设计 利用Primer Premier V5.0软件进行五重巢式 PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物，引物所扩增目的片段及扩增产物大小见表1。 1.2.3? 五重巢式PCR反应体系 1)第1轮五重PCR反应体系及反应条件。在第1轮五重PCR反应体系中，加DNA模板1uL(50 ng)，dNTP各0.4 mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液工（CP4 WF/ CP4 WR，0.8umol/L;Rbcl WF/Rbcl WR,0.3 umol/L;CryWF/Cry WR,0.25 umol/L;BAR WF/BAR WR,0.4umol/L; Pat WF/Pat WR，0.4 ptmol/L;)10 uL，DNA聚合酶4 U，补去离子水至50 uL。 扩增条件为：95℃预变性10 min; 95℃30 s，65℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，62℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，60℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，58℃60 s，72℃60 s，10个循环：72℃，10 min。 2)第2轮五重PCR反应体系及反应条件。取第1轮五重PCR产物1_uL作为模板，进行五重巢式PCR第2轮扩增。反应体系中加引物混合液Ⅱ(CP4 NF/ CP4 NR,0.6umol/L; Rbcl NF/Rbcl NR,0. 25 umol/L; CryNF/Cry NR,0.5umol/L; BAR NF/BAR NR,0.3 umol/L;Pat NF/Pat NR,0.6 umol/L;)