猪血红细胞sod分离纯化及活性分析.docVIP

猪血红细胞SOD分离纯化及活性分析 概述 自从人类从牛的红细胞中提取SOD以来，至今已经建立了一整套快速而有效的SOD分离及分析方法，并对它的化学、药理、临床及其作用机制进行了一系列研究。SOD无抗原性，不良反应较小，是很有临床价值的治疗酶，掌握其一整套完善实用的实验室制备技术具有深远意义。超氧化物歧化酶广泛存在于自然界各种生物体内，而目前动物血液是生产超氧化物歧化酶的主要原料，牛血和猪血较为常见，虽然猪血很少用于生产，但是鉴于猪血价格低廉且资源丰富，对于实验室研究制备比较适合。本实验中采用一系列技术方法对SOD进行提取纯化分析，虽然大部分都是一些常规技术，但是很多技术的细节前人尚不甚明了，因此与实验结果相比，本实验所应用的技术处理手段及其相关理论解释对后续实验者操作的启发意义显得更为重要，并且很多技术原理并不是局限于一种或一类实验而是广泛应用于化学研究领域的。 二．实验所用到的主要仪器与技术 仪器：大容量离心机，分光光度计，电泳槽，层析柱，紫外分光光度计，记录仪等等 技术：离心配平，洗涤溶胀，盐析，透析，电泳，分光光度法，柱层析等等。 所用到的试剂 3.8%柠檬酸钠，0.9%NaCl, 95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3HO2, KH2PO4, 丙酮，0.0025mol PH7.8磷酸钾缓冲液，1mol K2HPO4 90.8ml+1mol KH2PO4 9.2ml,稀释40倍。 比色分析试剂 BSA 冰醋酸 PAGE试剂 DEAE试剂 四．关键的试验 无水磷酸氢二钾盐析，磷酸钾缓冲液透析，蛋白质含量测定，SOD活性测定，PAGE电泳，DEAE柱层析，SOD精酶液蛋白含量测定，SOD精酶液SOD活性测定 五．实验流程 第一天：（1）取新鲜抗凝猪血800ml。在天平上与另外一组进行配平，由于对方重了一些，我组加入了一些备用的抗凝猪血。配平完后，放入大容量离心机，待其他组放好后，关上盖子，设置温度为4度，转速为2800rpm/min开始离心。转速由0经过大约1min后升到2800rpm/min。 （2）大约30min 后取回离心液，离心液分为两层，上层为血浆层，下层为血细胞层。倒掉血浆层液体，留下血细胞（主要为红细胞）。加入1到2倍体积的0.9%NaCl洗涤，加完后总体积大约是575ml，在温度4度，时间30min转速 2800rpm/min条件下离心 ，一共洗涤3次。作用：倾弃抗凝血的血浆及其杂质，获得压紧的干净的红细胞。 （3）加入等体积的蒸馏水，加完后体积大约是500ml左右。然后均匀搅拌，放入温度为4度得冰箱中过夜，使从分溶血。 第二天：（1）有机溶剂沉淀：从冰箱中取出溶血液，倒出上层清水，加入0.25倍体积的乙醇，0.15倍体积的氯仿,作用：乙醇用于吸水，脱去蛋白表面的氧化膜，氯仿用于使蛋白质变性。然后放在冷水浴中均匀搅拌15min,使血红蛋白沉淀，静置3小时左右。 （2）离心：再加入0.1体积的蒸馏水，均匀搅拌，在温度为4度，转速为2800rpm/min的条件下离心。 （3）盐析：离心后，取乙醇氯仿层。倒入大烧杯中，得到微微发黄的液体，其中有少量杂质漂浮。按100ml液体加入30g的比例加入无水磷酸氢二钾。然后均匀搅拌，静置3小时左右。 在盐析这一步中，开始等了将近4个小时也不见分层，只看到大烧杯中液体表面有微微发黄的杂质层。于是，为了寻找原因，将其取出，用胶头滴管穿过表层深入下层的澄清液中取了将近20ml液体加在小烧杯中。然后，再加入磷酸氢二钾固体（此数未记大概2到3钥匙），充分搅拌，再放入温度为4度得冰箱中静置。大概过了半小时左右，观察发现小烧杯中出现分层，上层大概占三分之一左右。于是猜想第一遍是磷酸氢二钾加入量不够的缘故（虽然加多了会破坏蛋白质结构，但是的确不够）。将大烧杯取出，用胶头滴管，取下层澄清液，取了大概150ml左右。加入了3勺磷酸氢二钾，均匀搅拌，又放回冰箱中。大约过了20几分钟出现明显的分层现象，上层微微泛黄。倒出上相液体。 （4）沉淀：取40ml所得到的液体于小试管中，加入30ml左右的冷丙酮，一边加入一边搅拌，可观察到有沉淀析出，在温度为4度，转速为2800rpm/min的条件下离心20min。取出，可以看到底部有沉淀，沉淀上有薄薄的一层物质（ＳＯＤ）。 （5）加入0.9%NaCl 15ml 溶解沉淀 （6）透析：将液体装在事先准备好的透析膜（透析膜要经过煮沸）中，封好，然后放在0.0025mol/LPH7.8磷酸钾的缓冲液中。保持温度为4度，透析12到24小时。 缓冲液的配置：取20.7克磷酸氢二钾和1.25克磷酸二氢钾，再加100ml蒸馏水，配制成溶液。再稀释40倍。 第三天：（1）离心：取出透析过后的液体，放入小离心管中，设定转速为2800rpm/min