dna复制的拓扑结构.ppt

第十三章 DNA的复制和修复 1958年，F.Crick提出中心法则,揭示了生物体内遗传信息的传递方向： （1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。 （2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。 （3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。 DNA生物合成：DNA复制和反转录 DNA的体外复制：分子克隆（PCR）。 第一节? DNA的复制 一、? DNA半保留复制机制 1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。 P321 图191 Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型 1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA，用密度梯度离心试验证明了DNA的复制是半保留复制。 P322 图19-2 DNA的半保留复制。 二、? 复制起点、单位和方向 DNA的复制是在起始阶段进行控制的。 1、?? 复制起点 复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。 有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。 多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A.T。 ★环状DNA复制起点的gene mapping P325 图19-6 ★复制起点的克隆和功能分析——重组质粒转化法 大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有1-2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到20以上，这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。 鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。 起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。 2、?? 复制单位 复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是都是环状双链分子，都是单复制子。 真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。 病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。 3、?? 复制方向 复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。 4、?? DNA的几种复制方式 （1）、??? 直线双向复制 单点，T7 多点，真核染色体DNA （2）、θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.） （3）、??? 滚环复制：环状单链DNA，Φx174 （4）、??? D环复制：线粒体、叶绿体DNA 不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。 （5）、??? 多复制叉复制： 第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。 DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上取决于起始频率。 E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟[4.2X106/（50KbX2）=42]。富营养时，可采取多复制叉复制方式，20min复制一代。 真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。 三、? 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子 （一） DNA聚合酶和DNA的聚合反应 1、?? DNA聚合反应必备的条件 ⑴ DNA聚合酶 ⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板) ⑶引物 (DNA、RNA) ⑷ 4种dNTP ⑸ Mg2+ 2、?? 聚合反应过程及特点 总反应式： P329 图19-10 P330图19-11 3、?? 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型 P331图19-12 （1）??? 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3＇羟基端回折成引物链。 （2）??? 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3’末端突出作为模板。 （3）??? 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。 （4）??? 环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板。 4、?? E.coli DNA聚合酶 （1）、E.co