trizol法提取猪苓总rna初探.doc

长白山药用真菌鸡爪苓菌丝体总RNA提取方法的比较 栾换东，战莹莹，姜颖越，许广波，李艳茹* （延边大学农学院，吉林 延吉 13300） 摘要：为了筛选出适合鸡爪苓菌丝体中总RNA提取的方法，本文采用Trizol法、Trizol改良1、2法、CTAB改良法提取鸡爪苓菌丝体的总RNA。结果显示：Trizol改良1、2法提取总RNA的质量与纯度优于Trizol法和CTAB改良法，LD-PCR成功合成鸡爪苓菌丝体cDNA产物，分布在500~5 000 bp之间，满足cDNA文库的建库要求。 关键词：鸡爪苓，菌丝体，总RNA，提取方法 Compared method for extraction total RNA from mycelium of chicken-claw-shaped polyporus umbellate of Changbai mountain LUAN Huan-dong, ZHAN Ying-ying, JIANG Ying-yue， XU Guang-bo ，LI Yan-ru* (Agricultural College of Yanbian University，Yanji 13300，China) ABSTRACT：In order to select suitable method for extraction?total RNA from mycelium of chicken-claw-shaped polyporus umbellate, they were compared among Trizol method, improved Trizol method 1 and 2 and CTAB method. The results showed that the uality and purity of extraction of total RNA which using improved Trizol method 1 and 2 is superior to Trizol method and the improved CTAB method, LD - PCR successed synthesis of chicken-claw-shaped polyporus umbellate mycelium cDNA product, Distribution between 500 ~ 000 bp，meet the?requirements of cDNA library construction. Keywords：chicken-claw-shaped polyporus umbellate, mycelium, total RNA, extraction method (鸡爪苓主要分布在长白山区，而且是特有的野生猪苓 [Polyponus umbellatus (Pers.) Fr] 资源。猪苓的生长周期包括菌丝体生长、菌核发育和子实体形成等 3 个阶段。猪苓是我国传统的真菌类中药材，中医临床上常以干燥的菌核入药，药用历史已有2 000多年 [1-4]。目前，国内学者对猪苓的研究多集中在生物学特性和人工栽培技术等方面[5]。随着分子生物学研究的深入，有关猪苓的分子生物学研究也逐渐开展，邢晓科[6]等人采用核糖体基因（nrDNA）序列分析对不同地区猪苓种属间的亲缘关系进行了分类研究，但是关于从猪苓中提取RNA的方法以及针对长白山鸡爪苓的相关研究还未见报道。 RNA是存在于生物细胞中重要遗传信息的载体。总RNA 提取技术是一项分子生物学基本实验技术，提取高纯度完整的总RNA是进行cDNA文库构建、Northern 印迹杂交、荧光定量PCR等下游实验的首要环节和关键步骤[7-9]。鸡爪苓菌丝体属于丝状真菌细胞，其细胞壁中含有几丁质、葡聚糖、脂类和肽类等结构物质，鸡爪苓菌丝体在培养后期能够形成拟菌核，细胞内的多糖、多酚和蛋白质等活性物质明显增加，不仅严重影响RNA的提取效率，还会影响RNA的完整性和产量，不能满足后续试验的要求。为此，笔者采用Trizol法、Trizol改良1法、Trizol改良2法和CTAB法来提取鸡爪苓菌丝体中的总RNA，通过RNA的产量、完整性及纯度比较，来确定适合于从鸡爪苓菌丝体中提取总RNA的高效快捷方法，为下一步构建鸡爪苓全长cDNA文库奠定试验基础。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1 鸡爪苓菌丝体由采自长白山区野生鸡爪苓菌核经组织分离后得到，该菌株经纯化后保存于延边大学微生物学与免疫学教学实验中心。 1.1.2 DEPC 购于 Solarbio 公司，Trizol? Reagent 购于 Invitrogen 公司，Advantage? 2